304 ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲ ਟਿਊਬਿੰਗ ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪੋਨੈਂਟ, SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦੀ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।

Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਪ੍ਰਤੀ ਸਲਾਈਡ ਤਿੰਨ ਲੇਖ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਸਲਾਈਡਰ।ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਪਿੱਛੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਹਰ ਇੱਕ ਸਲਾਈਡ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡ ਕੰਟਰੋਲਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।

SPACA6 ਇੱਕ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੀ ਸਤਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜੋ ਕਿ ਥਣਧਾਰੀ ਜਿਨਸੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਇਸ ਬੁਨਿਆਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, SPACA6 ਦੇ ਖਾਸ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਮਾੜਾ ਸਮਝਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ 2.2 Å ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 'ਤੇ SPACA6 ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਇੱਕ ਦੋ-ਡੋਮੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਜੋ ਇੱਕ ਚਾਰ-ਫਸੇ ਬੰਡਲ ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਅਰਧ-ਲਚਕੀਲੇ ਲਿੰਕਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਇਹ ਢਾਂਚਾ IZUMO1 ਵਰਗਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਹੋਰ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਨੂੰ ਗਰੱਭਧਾਰਣ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਸੰਸਥਾਪਕ ਮੈਂਬਰ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਇੱਥੇ IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਨੂੰ ਇਸਦੇ ਮਰੋੜੇ ਚਾਰ-ਹੇਲਿਕਸ ਬੰਡਲ ਅਤੇ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ-ਲਿੰਕਡ CXXC ਮੋਟਿਫਸ ਦੀ ਇੱਕ ਜੋੜੀ ਦੁਆਰਾ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੀ ਇੱਕ ਬਣਤਰ-ਅਧਾਰਿਤ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਖੋਜ ਨੇ ਇਸ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਵਾਧੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੈਂਬਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ;ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।SPACA6 ਢਾਂਚਾ ਅਤੇ IST ਦੇ ਦੂਜੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਨਾਲ ਇਸ ਦਾ ਸਬੰਧ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਥਣਧਾਰੀ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਦੇ ਸਾਡੇ ਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਗੁੰਮ ਲਿੰਕ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਹਰ ਮਨੁੱਖੀ ਜੀਵਨ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹੈਪਲੋਇਡ ਗੇਮੇਟਸ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ: ਪਿਤਾ ਦਾ ਸ਼ੁਕਰਾਣੂ ਅਤੇ ਮਾਂ ਦਾ ਅੰਡੇ।ਇਹ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਇੱਕ ਤੀਬਰ ਚੋਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਜੇਤੂ ਹੈ ਜਿਸ ਦੌਰਾਨ ਲੱਖਾਂ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਸੈੱਲ ਮਾਦਾ ਜਣਨ ਟ੍ਰੈਕਟ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਦੇ ਹਨ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸਮਰੱਥਾ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਸਤਹ ਦੇ ਭਾਗਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ 2,3,4।ਭਾਵੇਂ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਅਤੇ oocyte ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਨੂੰ ਲੱਭ ਲੈਂਦੇ ਹਨ, ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਅਜੇ ਖਤਮ ਨਹੀਂ ਹੋਈ ਹੈ।oocyte cumulus ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਪਰਤ ਅਤੇ ਇੱਕ ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰੁਕਾਵਟ ਨਾਲ ਘਿਰਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਜਿਸਨੂੰ ਜ਼ੋਨਾ ਪੇਲੁਸੀਡਾ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚੋਂ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਨੂੰ ਓਓਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਲਈ ਲੰਘਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਇਨ੍ਹਾਂ ਅੰਤਮ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਲਈ ਸਤ੍ਹਾ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਅਣੂਆਂ ਅਤੇ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਅਤੇ ਗੁਪਤ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਅਣੂ ਅਤੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਝਿੱਲੀ ਅਤੇ ਐਕਰੋਸੋਮਲ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਦੀ ਬਾਹਰੀ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਐਕਰੋਸੋਮਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੀਬਰ ਯਾਤਰਾ ਦਾ ਅੰਤਮ ਪੜਾਅ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ-ਅੰਡੇ ਦੀ ਸੰਯੋਜਨ ਘਟਨਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸੈੱਲ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਡਿਪਲੋਇਡ ਜੀਵ ਬਣਨ ਲਈ ਆਪਣੀ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਫਿਊਜ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ, ਪਰ ਜ਼ਰੂਰੀ ਅਣੂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਮਾੜਾ ਸਮਝਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਗੇਮੇਟਸ ਦੇ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਦੋ ਲਿਪਿਡ ਬਾਇਲੇਅਰਾਂ ਦੇ ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਰਸਾਇਣ ਦਾ ਵਿਆਪਕ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਝਿੱਲੀ ਫਿਊਜ਼ਨ ਇੱਕ ਊਰਜਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕੂਲ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੈ ਜਿਸ ਲਈ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਨੂੰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਤਬਦੀਲੀ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਦੋ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਲਿਆਉਂਦੀ ਹੈ, ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਨਿਰੰਤਰਤਾ ਨੂੰ ਤੋੜਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ 8,9 ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ fusogens ਵਜੋਂ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਅਣਗਿਣਤ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਇਹ ਹੋਸਟ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਲ ਐਂਟਰੀ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਹਨ (ਜਿਵੇਂ, HIV-1 ਵਿੱਚ gp160, ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ ਸਪਾਈਕ, ਇਨਫਲੂਐਂਜ਼ਾ ਵਾਇਰਸਾਂ ਵਿੱਚ ਹੇਮਾਗਗਲੂਟਿਨਿਨ) 10,11,12 ਪਲੇਸੈਂਟਲ (ਸਿੰਸੀਟਿਨ) 13,14,15 ਅਤੇ ਹੇਠਲੇ ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ ਵਿੱਚ ਗੇਮੇਟ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ( HAP2/GCS1 ਪੌਦਿਆਂ, ਪ੍ਰੋਟਿਸਟ ਅਤੇ ਆਰਥਰੋਪੌਡਜ਼ ਵਿੱਚ) 16,17,18,19।ਮਨੁੱਖੀ ਗੇਮੇਟਾਂ ਲਈ ਫਿਊਸੋਜਨਾਂ ਦੀ ਅਜੇ ਖੋਜ ਹੋਣੀ ਬਾਕੀ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਕਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗੇਮੇਟ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਾਬਤ ਹੋਏ ਹਨ।oocyte-expressed CD9, ਮਾਊਸ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਗੇਮੇਟਸ ਦੇ ਸੰਯੋਜਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, 21,22,23 ਖੋਜਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਪਹਿਲਾ ਸੀ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸਦਾ ਸਟੀਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਅਸਪਸ਼ਟ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ, ਅਡੈਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ, ਅੰਡੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵਿਲੀ ਉੱਤੇ ਅਡੈਸ਼ਨ ਫੋਸੀ ਦੀ ਬਣਤਰ, ਅਤੇ/ਜਾਂ oocyte ਸਤਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਸਹੀ ਸਥਾਨੀਕਰਨ 24,25,26 ਸੰਭਾਵਿਤ ਲੱਗਦਾ ਹੈ।ਦੋ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਨ ਉਹ ਹਨ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ IZUMO127 ਅਤੇ oocyte ਪ੍ਰੋਟੀਨ JUNO28, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਆਪਸੀ ਸਬੰਧ ਫਿਊਜ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਗੇਮੇਟ ਦੀ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਅਡਜਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਦਮ ਹੈ।ਨਰ Izumo1 ਨਾਕਆਊਟ ਚੂਹੇ ਅਤੇ ਮਾਦਾ ਜੂਨੋ ਨਾਕਆਊਟ ਚੂਹੇ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਰਜੀਵ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇਹਨਾਂ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪੇਰੀਵਿਟਲਾਈਨ ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਪਰ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸੰਗਮ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ ਜੈਮੇਟਸ ਨੂੰ ਐਂਟੀ-IZUMO1 ਜਾਂ JUNO27,29 ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਮਨੁੱਖੀ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਫਰਟੀਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, IZUMO1 ਅਤੇ JUNO20,30,31,32,33,34,35 ਦੇ ਸਮਾਨ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ-ਪ੍ਰਗਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਮੂਹ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਐਕਰੋਸੋਮਲ ਮੇਮਬ੍ਰੇਨ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 6 (SPACA6) ਨੂੰ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੈਮਾਨੇ ਦੇ ਮਿਊਰੀਨ ਮਿਊਟੇਜੇਨੇਸਿਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।Spaca6 ਜੀਨ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਜੀਨ ਦਾ ਸੰਮਿਲਨ ਗੈਰ-ਫਿਊਜ਼ੀਬਲ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪੇਰੀਵਿਟਲਾਈਨ ਸਪੇਸ 36 ਵਿੱਚ ਘੁਸਪੈਠ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਬਾਅਦ ਦੇ ਨਾਕਆਊਟ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ 30,32 ਲਈ Spaca6 ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।SPACA6 ਲਗਭਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੰਡਕੋਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਸਥਾਨਕਕਰਨ ਪੈਟਰਨ IZUMO1 ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਅਰਥਾਤ ਐਕਰੋਸੋਮਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਿੱਸੇ ਦੇ ਅੰਦਰ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਐਕਰੋਸੋਮਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 30,32 ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਭੂਮੱਧ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵਾਸ ਕਰਦਾ ਹੈ।Spaca6 ਸਮਰੂਪ ਕਈ ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ ਅਤੇ ਹੋਰ ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ 30 ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ ਇਸਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ SPACA6 30 ਦੇ ਵਿਰੋਧ ਦੁਆਰਾ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।IZUMO1 ਅਤੇ JUNO ਦੇ ਉਲਟ, SPACA6 ਦੀ ਬਣਤਰ, ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਅਤੇ ਕਾਰਜ ਦੇ ਵੇਰਵੇ ਅਸਪਸ਼ਟ ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ।
ਮਨੁੱਖੀ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਅਤੇ ਅੰਡਿਆਂ ਦੇ ਸੰਯੋਜਨ ਦੇ ਅੰਤਰਗਤ ਬੁਨਿਆਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸਮਝਣ ਲਈ, ਜੋ ਸਾਨੂੰ ਪਰਿਵਾਰ ਨਿਯੋਜਨ ਅਤੇ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਦੇ ਇਲਾਜ ਵਿੱਚ ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਸੂਚਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਬਣਾਏਗੀ, ਅਸੀਂ SPACA6 ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਤੇ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ।SPACA6 ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ ਇੱਕ ਚਾਰ-ਹੇਲੀਕਲ ਬੰਡਲ (4HB) ਅਤੇ ਇੱਕ ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ-ਵਰਗੇ (Ig-ਵਰਗੇ) ਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਅਰਧ-ਲਚਕੀਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਜੁੜਿਆ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, 7,32,37 SPACA6 ਦੀ ਡੋਮੇਨ ਬਣਤਰ ਮਨੁੱਖੀ IZUMO1 ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਅਤੇ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੱਕ ਅਸਾਧਾਰਨ ਰੂਪ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ: 4HB ਇੱਕ ਤਿਕੋਣੀ ਹੈਲੀਕਲ ਸਤਹ ਅਤੇ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ-ਲਿੰਕਡ CXXC ਮੋਟਿਫਸ ਦੀ ਇੱਕ ਜੋੜੀ ਦੇ ਨਾਲ।ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਹੁਣ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ, ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਲਈ ਵਿਲੱਖਣ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਸਟ੍ਰਕਚਰਲ ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਖੋਜ ਕੀਤੀ, ਇਸ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਵਾਧੂ ਮੈਂਬਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਈ ਮੈਂਬਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇਹ ਹੁਣ ਜਾਪਦਾ ਹੈ ਕਿ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਇੱਕ ਸਾਂਝਾ ਢਾਂਚਾਗਤ ਫੋਲਡ ਅਤੇ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਾਡੀ ਬਣਤਰ ਮਨੁੱਖੀ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿਧੀ ਦੇ ਇਸ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪਹਿਲੂ ਦਾ ਇੱਕ ਅਣੂ ਨਕਸ਼ਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ।
SPACA6 ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ-ਪਾਸ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ N-ਲਿੰਕਡ ਗਲਾਈਕਨ ਅਤੇ ਛੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ (ਅੰਕੜੇ S1a ਅਤੇ S2) ਹਨ।ਅਸੀਂ ਡਰੋਸੋਫਿਲਾ S2 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ SPACA6 (ਅਵਸ਼ੇਸ਼ 27–246) ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਨਿੱਕਲ ਐਫੀਨਿਟੀ, ਕੈਸ਼ਨ ਐਕਸਚੇਂਜ, ਅਤੇ ਸਾਈਜ਼ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (Fig. S1b) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ।ਸ਼ੁੱਧ SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਬਹੁਤ ਸਥਿਰ ਅਤੇ ਸਮਰੂਪ ਹੈ।ਪੌਲੀਗੋਨਲ ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ (SEC-MALS) ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਆਕਾਰ ਦੀ ਬੇਦਖਲੀ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c) ਦੇ ਗਣਿਤ ਅਣੂ ਭਾਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਚੋਟੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਇਹ SPACA6 ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦੇ ਆਕਾਰ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਦੌਰਾਨ ਓਲੀਗੋਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਹੋਈ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਰਕੂਲਰ ਡਾਇਕਰੋਇਜ਼ਮ (CD) ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਨੇ 51.3 °C (Fig. S1d,e) ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਬਿੰਦੂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮਿਸ਼ਰਤ α/β ਬਣਤਰ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਸੀਡੀ ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ ਦੇ ਡੀਕਨਵੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨੇ 38.6% α-ਹੇਲੀਕਲ ਅਤੇ 15.8% β-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਤੱਤ (ਚਿੱਤਰ S1d) ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ।
SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਸੀਡਿੰਗ38 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕ੍ਰਿਸਟਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ 2.2 Å (ਸਾਰਣੀ 1 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S3) ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨਾਲ ਇੱਕ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਨਿਰਧਾਰਨ (ਟੇਬਲ 1 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S4) ਲਈ ਬ੍ਰੋਮਾਈਡ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਦੇ ਨਾਲ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟ-ਅਧਾਰਿਤ ਅਣੂ ਬਦਲ ਅਤੇ SAD ਫੇਜ਼ਿੰਗ ਡੇਟਾ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਫਾਈਨਲ ਰਿਫਾਈਨਡ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ 27-246 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਜਦੋਂ ਢਾਂਚਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਉੱਥੇ ਕੋਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਜਾਂ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਢਾਂਚੇ ਉਪਲਬਧ ਨਹੀਂ ਸਨ।SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ 20 Å × 20 Å × 85 Å ਮਾਪਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੱਤ ਹੈਲੀਸ ਅਤੇ ਨੌ β-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਛੇ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1a, b) ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਇੱਕ ਲੰਬਾ ਤੀਜਾ ਫੋਲਡ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।Asn243 ਸਾਈਡ ਚੇਨ ਦੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਕਮਜ਼ੋਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਘਣਤਾ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਇੱਕ N-ਲਿੰਕਡ ਗਲਾਈਕੋਸੀਲੇਸ਼ਨ ਹੈ।ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ: ਇੱਕ N-ਟਰਮੀਨਲ ਚਾਰ-ਹੇਲਿਕਸ ਬੰਡਲ (4HB) ਅਤੇ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਵਿਚਕਾਰਲਾ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1c)।
SPACA6 ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਢਾਂਚਾ।SPACA6 ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਸਟ੍ਰਿਪ ਡਾਇਗਰਾਮ, N ਤੋਂ C-ਟਰਮਿਨਸ ਤੱਕ ਗੂੜ੍ਹੇ ਨੀਲੇ ਤੋਂ ਗੂੜ੍ਹੇ ਲਾਲ ਤੱਕ ਚੇਨ ਦਾ ਰੰਗ।ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਸਿਸਟੀਨ ਮੈਜੈਂਟਾ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।b SPACA6 ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਟੋਪੋਲੋਜੀ।ਉਹੀ ਰੰਗ ਸਕੀਮ ਵਰਤੋ ਜੋ ਚਿੱਤਰ 1a ਵਿੱਚ ਹੈ।c SPACA6 ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ।4HB, ਹਿੰਗ, ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਸਟ੍ਰਿਪ ਚਾਰਟ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਸੰਤਰੀ, ਹਰੇ ਅਤੇ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਦੇ ਹਨ।ਪਰਤਾਂ ਨੂੰ ਸਕੇਲ ਲਈ ਨਹੀਂ ਖਿੱਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
SPACA6 ਦੇ 4HB ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਮੁੱਖ ਹੈਲਿਕਸ (ਹੇਲੀਸ 1–4) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਹੈਲੀਕਲ ਹੈਲਿਕਸ (Fig. 2a) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵਿਵਸਥਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਐਂਟੀਪੈਰਲਲ ਅਤੇ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ (Fig. 2b) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਬਦਲਦੇ ਹੋਏ।ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਵਾਧੂ ਸਿੰਗਲ-ਟਰਨ ਹੈਲਿਕਸ (ਹੈਲਿਕਸ 1′) ਬੰਡਲ ਦੇ ਲੰਬਵਤ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਹੈਲੀਸ 1 ਅਤੇ 2 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਤਿਕੋਣ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਤਿਕੋਣ ਹੈਲੀਸ 3 ਅਤੇ 4 (3 ਅਤੇ 4) ਦੀ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸੰਘਣੀ ਪੈਕਿੰਗ ਦੀ ਹੈਲੀਕਲ-ਟਵਿਸਟਡ ਪੈਕਿੰਗ ਵਿੱਚ ਥੋੜ੍ਹਾ ਵਿਗੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ 2a)।
4HB N-ਟਰਮੀਨਲ ਸਟ੍ਰਿਪ ਚਾਰਟ।b ਚਾਰ ਹੈਲਿਕਸ ਦੇ ਬੰਡਲ ਦਾ ਸਿਖਰ ਦਾ ਦ੍ਰਿਸ਼, ਹਰੇਕ ਹੈਲਿਕਸ N-ਟਰਮੀਨਸ 'ਤੇ ਗੂੜ੍ਹੇ ਨੀਲੇ ਅਤੇ C-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਗੂੜ੍ਹੇ ਲਾਲ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।c 4HB ਲਈ ਟੌਪ-ਡਾਊਨ ਸਪਿਰਲ ਵ੍ਹੀਲ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ, ਹਰੇਕ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ-ਅੱਖਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕੋਡ ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਚੱਕਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ;ਪਹੀਏ ਦੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਸਿਰਫ਼ ਚਾਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਹੀ ਗਿਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਗੈਰ-ਧਰੁਵੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਪੀਲੇ ਰੰਗ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਧਰੁਵੀ ਚਾਰਜ ਰਹਿਤ ਖੂੰਹਦ ਰੰਗੀਨ ਹਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦਾ ਰੰਗ ਨੀਲਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਲਾਲ ਰੰਗ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।d 4HB ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਤਿਕੋਣੀ ਚਿਹਰੇ, ਸੰਤਰੀ ਵਿੱਚ 4HB ਅਤੇ ਹਰੇ ਵਿੱਚ ਟਿਕੇ ਹੋਏ ਹਨ।ਦੋਵੇਂ ਇਨਸੈੱਟ ਡੰਡੇ ਦੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।
4HB ਇੱਕ ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਹੈ ਜੋ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਲੀਫੇਟਿਕ ਅਤੇ ਖੁਸ਼ਬੂਦਾਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (ਚਿੱਤਰ 2c) ਨਾਲ ਬਣਿਆ ਹੈ।ਕੋਰ ਵਿੱਚ Cys41 ਅਤੇ Cys55 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬੰਧਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਉੱਪਰਲੇ ਤਿਕੋਣ (ਚਿੱਤਰ 2d) ਵਿੱਚ ਹੈਲੀਸ 1 ਅਤੇ 2 ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।ਹੈਲਿਕਸ 1′ ਵਿੱਚ CXXC ਮੋਟਿਫ਼ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਦੋ ਵਾਧੂ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਹੋਰ CXXC ਮੋਟਿਫ਼ ਜੋ ਕਿ ਕਬਜ਼ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ β-ਹੇਅਰਪਿਨ ਦੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2d)।ਇੱਕ ਅਣਜਾਣ ਫੰਕਸ਼ਨ (Arg37) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਰੂੜ੍ਹੀਵਾਦੀ ਆਰਜੀਨਾਈਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 1′, 1, ਅਤੇ 2 ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਇੱਕ ਖੋਖਲੇ ਤਿਕੋਣ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਥਿਤ ਹੈ। ਅਲਿਫੇਟਿਕ ਕਾਰਬਨ ਐਟਮ Cβ, Cγ, ਅਤੇ Cδ Arg37 ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਗੁਆਨੀਡੀਨ ਸਮੂਹ ਚੱਕਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੱਗੇ ਵਧਦੇ ਹਨ। Thr32 ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਅਤੇ ਸਾਈਡ ਚੇਨ (ਚਿੱਤਰ S5a,b) ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਰਾਹੀਂ ਹੈਲੀਸ 1′ ਅਤੇ 1 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ।Tyr34 ਦੋ ਛੋਟੀਆਂ ਕੈਵਿਟੀਜ਼ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਕੈਵਿਟੀ ਵਿੱਚ ਫੈਲਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਰਾਹੀਂ Arg37 ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
Ig-ਵਰਗੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਡੋਮੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਹੈ ਜੋ ਦੋ ਜਾਂ ਦੋ ਤੋਂ ਵੱਧ ਮਲਟੀ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਐਮਫੀਪੈਥਿਕ β-ਸ਼ੀਟਾਂ ਦੀ ਸਾਂਝੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ 39 ਦੁਆਰਾ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। SPACA6 ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਸਮਾਨ ਪੈਟਰਨ ਹੈ। ਅਤੇ ਦੋ ਪਰਤਾਂ (Fig. S6a) ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸ਼ੀਟ 1 ਚਾਰ ਤਾਰਾਂ (ਸਟਰੈਂਡਾਂ D, F, H, ਅਤੇ I) ਦੀ ਇੱਕ β-ਸ਼ੀਟ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਤਾਰਾਂ F, H, ਅਤੇ I ਇੱਕ ਐਂਟੀ-ਪੈਰਲਲ ਪ੍ਰਬੰਧ ਬਣਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ I ਅਤੇ D ਇੱਕ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਾਰਣੀ 2 ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਐਂਟੀ-ਪੈਰਲਲ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਬੀਟਾ ਸ਼ੀਟ ਹੈ (ਸਟੈਂਡਸ E ਅਤੇ G)।ਈ ਚੇਨ ਦੇ C-ਟਰਮਿਨਸ ਅਤੇ H ਚੇਨ (Cys170-Cys226) (Fig. S6b) ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਅੰਦਰੂਨੀ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ 40,41 ਦੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ।
ਚਾਰ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ β-ਸ਼ੀਟ ਆਪਣੀ ਪੂਰੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਨਾਲ ਮਰੋੜਦੀ ਹੈ, ਅਸਮਿਤ ਕਿਨਾਰੇ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ ਜੋ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕਸ ਵਿੱਚ ਭਿੰਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਪਤਲਾ ਕਿਨਾਰਾ ਇੱਕ ਸਮਤਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਵਾਤਾਵਰਨ ਸਤਹ ਹੈ ਜੋ SPACA6 (Fig. S6b,c) ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਅਸਮਾਨ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਭਿੰਨ ਸਤਹਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਵੱਖਰਾ ਹੈ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਸਤਹ (ਚਿੱਤਰ S6c) ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਈ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਕਾਰਬੋਨੀਲ/ਅਮੀਨੋ ਸਮੂਹਾਂ ਅਤੇ ਪੋਲਰ ਸਾਈਡ ਚੇਨਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਪਰਭਾਗ।ਵਿਸ਼ਾਲ ਹਾਸ਼ੀਏ ਨੂੰ ਇੱਕ ਕੈਪਡ ਹੈਲੀਕਲ ਖੰਡ ਦੁਆਰਾ ਕਵਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਜੋ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ F ਚੇਨ ਬੈਕਬੋਨ (Fig. S6d) ਦੇ ਖੁੱਲੇ ਧਰੁਵੀ ਸਮੂਹ ਦੇ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਕਿਨਾਰੇ ਦਾ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿੱਸਾ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਕਸਪੋਜ਼ਡ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਜੇਬ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਡਬਲ ਆਰਜੀਨਾਈਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਤਿੰਨ ਸੈੱਟਾਂ (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ਅਤੇ Arg212-Arg214) ਅਤੇ ਇੱਕ ਕੇਂਦਰੀ ਹਿਸਟੀਡਾਈਨ (His220) (ਚਿੱਤਰ S6e) ਕਾਰਨ ਜੇਬ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜਾਂ ਨਾਲ ਘਿਰੀ ਹੋਈ ਹੈ।
ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਹੈਲੀਕਲ ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਆਈਜੀ-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਖੰਡ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਐਂਟੀ-ਪੈਰਲਲ ਤਿੰਨ-ਸਟੈਂਡਡ β-ਪਰਤ (ਸਟ੍ਰੈਂਡਸ A, B ਅਤੇ C), ਇੱਕ ਛੋਟਾ 310 ਹੈਲਿਕਸ, ਅਤੇ ਕਈ ਲੰਬੇ ਬੇਤਰਤੀਬ ਹੈਲੀਕਲ ਖੰਡ ਹਨ।(ਚਿੱਤਰ S7).ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਕੋਵਲੈਂਟ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸੰਪਰਕਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਨੈਟਵਰਕ 4HB ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਵਿਚਕਾਰ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਦਾ ਪ੍ਰਤੀਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਨੈੱਟਵਰਕ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪਹਿਲੇ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਦੋ CXXC ਮੋਟਿਫ਼ (27CXXC30 ਅਤੇ 139CXXC142) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਜੋ ਕਿ ਕਬਜ਼ ਵਿੱਚ β-ਹੇਅਰਪਿਨ ਅਤੇ 4HB ਵਿੱਚ 1′ ਹੈਲਿਕਸ ਵਿਚਕਾਰ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਦੂਜੇ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਆਈਜੀ-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਹਿੰਗ ਵਿਚਕਾਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਕਬਜੇ ਵਿੱਚ Glu132 Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ Arg233 ਅਤੇ ਕਬਜੇ ਵਿੱਚ Arg135 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਨਮਕ ਪੁਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਤੀਜੇ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਆਈਜੀ-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਹਿ-ਸਹਿਯੋਗੀ ਬੰਧਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਦੋ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ (Cys124-Cys147 ਅਤੇ Cys128-Cys153) ਹਿੰਗ ਲੂਪ ਨੂੰ ਇੱਕ ਲਿੰਕਰ ਨਾਲ ਜੋੜਦੇ ਹਨ ਜੋ Gln131 ਅਤੇ ਬੈਕਬੋਨ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਗਰੁੱਪ ਵਿਚਕਾਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਪਹਿਲੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਚੇਨ
SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦੀ ਬਣਤਰ ਅਤੇ 4HB ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾਬੇਸ 42 ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਰਿਕਾਰਡਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਸੀਂ ਉੱਚ ਡਾਲੀ ਜ਼ੈੱਡ ਸਕੋਰ, ਛੋਟੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ, ਅਤੇ ਵੱਡੇ LALI ਸਕੋਰ (ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਰਾਬਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸੰਖਿਆ) ਵਾਲੇ ਮੈਚਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।ਜਦੋਂ ਕਿ ਪੂਰੀ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਖੋਜ (ਟੇਬਲ S1) ਦੀਆਂ ਪਹਿਲੀਆਂ 10 ਹਿੱਟਾਂ ਵਿੱਚ >842 ਦਾ ਇੱਕ ਸਵੀਕਾਰਯੋਗ Z-ਸਕੋਰ ਸੀ, 4HB ਜਾਂ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਲਈ ਇੱਕ ਖੋਜ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਹਿੱਟ ਸਿਰਫ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਸਰਵ ਵਿਆਪਕ ਫੋਲਡ।ਡਾਲੀ ਵਿੱਚ ਸਾਰੀਆਂ ਤਿੰਨ ਖੋਜਾਂ ਨੇ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਨਤੀਜਾ ਦਿੱਤਾ: IZUMO1।
ਇਹ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 7,32,37 ਦੀਆਂ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ-ਸਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਸਿਰਫ 21% ਕ੍ਰਮ ਪਛਾਣ (ਚਿੱਤਰ S8a) ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸਬੂਤ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਪੈਟਰਨ ਅਤੇ SPACA6 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪੂਰਵ ਅਨੁਮਾਨਿਤ C-ਟਰਮੀਨਲ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਨੇ ਇੱਕ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ਾਂ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ। IZUMO1 ਨੂੰ ਟੈਂਪਲੇਟ 37 ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ A ਇੱਕ SPACA6 ਮਾਊਸ ਦਾ ਸਮਰੂਪਤਾ ਮਾਡਲ।ਸਾਡਾ ਢਾਂਚਾ ਇਹਨਾਂ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਮਾਨਤਾ ਦੀ ਸਹੀ ਡਿਗਰੀ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, SPACA6 ਅਤੇ IZUMO137,43,44 ਢਾਂਚੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ 4HB ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਦੋ-ਡੋਮੇਨ ਆਰਕੀਟੈਕਚਰ (Fig. S8b) ਨੂੰ ਇੱਕ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ (Fig. S8c) ਦੁਆਰਾ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ।
IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 4HB ਵਿੱਚ ਰਵਾਇਤੀ ਸਪਿਰਲ ਬੰਡਲਾਂ ਤੋਂ ਆਮ ਅੰਤਰ ਹਨ।ਆਮ 4HBs, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਂਡੋਸੋਮਲ ਫਿਊਜ਼ਨ 45,46 ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ SNARE ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇੱਕ ਕੇਂਦਰੀ ਧੁਰੀ 47 ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਵਕਰਤਾ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਬਰਾਬਰ ਦੂਰੀ ਵਾਲੇ ਹੈਲੀਸ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਦੋਵਾਂ ਵਿੱਚ ਹੈਲੀਕਲ ਡੋਮੇਨ ਵਿਗੜ ਗਏ ਸਨ, ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਕਰਵਚਰ ਅਤੇ ਨਾਲ। ਅਸਮਾਨ ਪੈਕਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ S8d)।ਮੋੜ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੈਲਿਕਸ 1′, 1 ਅਤੇ 2 ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਤਿਕੋਣ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਵਿੱਚ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਹੈਲਿਕਸ 1′ 'ਤੇ ਉਸੇ CXXC ਮੋਟਿਫ਼ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, SPACA6 ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਵਾਧੂ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ (Cys41 ਅਤੇ Cys55 covalently helices 1 ਅਤੇ 2 ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ) ਤਿਕੋਣ ਦੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਤਿੱਖਾ ਸਿਖਰ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, SPACA6 ਨੂੰ IZUMO1 ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਮਰੋੜਿਆ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਵਧੇਰੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕੈਵਿਟੀ ਤਿਕੋਣਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, IZUMO1 ਵਿੱਚ SPACA6 ਵਿੱਚ ਇਸ ਕੈਵਿਟੀ ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ Arg37 ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, IZUMO1 ਵਿੱਚ ਅਲਿਫੇਟਿਕ ਅਤੇ ਸੁਗੰਧਿਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਇੱਕ ਵਧੇਰੇ ਆਮ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਕੋਰ ਹੈ।
IZUMO1 ਕੋਲ ਇੱਕ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਅਤੇ ਪੰਜ-ਫਸੇ ਹੋਏ β-ਸ਼ੀਟ43 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।IZUMO1 ਵਿੱਚ ਵਾਧੂ ਸਟ੍ਰੈਂਡ SPACA6 ਵਿੱਚ ਕੋਇਲ ਨੂੰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਵਿੱਚ ਬੈਕਬੋਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਸੀਮਿਤ ਕਰਨ ਲਈ F ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਤੁਲਨਾ ਦਾ ਇੱਕ ਦਿਲਚਸਪ ਬਿੰਦੂ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦਾ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਸਤਹ ਚਾਰਜ ਹੈ।IZUMO1 ਸਤ੍ਹਾ SPACA6 ਸਤਹ ਨਾਲੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਚਾਰਜ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਝਿੱਲੀ ਦਾ ਸਾਹਮਣਾ ਕਰ ਰਹੇ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ ਦੇ ਨੇੜੇ ਸਥਿਤ ਹੈ।SPACA6 ਵਿੱਚ, ਉਹੀ ਖੇਤਰ ਵਧੇਰੇ ਨਿਰਪੱਖ ਜਾਂ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (Fig. S8e)।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, SPACA6 ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਸਤਹ (ਪਤਲੇ ਕਿਨਾਰੇ) ਅਤੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਟੋਏ (ਚੌੜੇ ਕਿਨਾਰੇ) IZUMO1 ਵਿੱਚ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਹਾਲਾਂਕਿ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਤੱਤ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਨ, Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੀ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਦੋ ਡੋਮੇਨ ਇੱਕ ਦੂਜੇ (Fig. S9) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਆਮ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਹਨ।IZUMO1 ਦਾ ਸਪਿਰਲ ਬੰਡਲ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਦੇ ਦੁਆਲੇ ਵਕਰਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਕੇਂਦਰੀ ਧੁਰੇ ਤੋਂ ਲਗਭਗ 50° 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਿਤ "ਬੂਮਰੈਂਗ" ਆਕਾਰ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਉਲਟ, SPACA6 ਵਿੱਚ ਹੈਲੀਕਲ ਬੀਮ ਉਲਟ ਦਿਸ਼ਾ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 10° ਝੁਕੀ ਹੋਈ ਸੀ।ਇਹਨਾਂ ਦਿਸ਼ਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹਨ।ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕ੍ਰਮ ਪੱਧਰ 'ਤੇ, IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਸਿਸਟੀਨ, ਗਲਾਈਸੀਨ, ਅਤੇ ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਅਪਵਾਦ ਦੇ ਨਾਲ, ਕਬਜੇ 'ਤੇ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਕ੍ਰਮ ਸਮਾਨਤਾ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਨੈਟਵਰਕ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵੱਖਰੇ ਹਨ।β-ਸ਼ੀਟ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੇ ਤੱਤ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਦੁਆਰਾ ਸਾਂਝੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ IZUMO1 ਵਿੱਚ ਚੇਨ ਬਹੁਤ ਲੰਬੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ 310 ਹੈਲਿਕਸ (ਹੇਲਿਕਸ 5) SPACA6 ਲਈ ਵਿਲੱਖਣ ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਅੰਤਰਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਦੋ ਹੋਰ ਸਮਾਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਡੋਮੇਨ ਸਥਿਤੀਆਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।
ਸਾਡੀ ਡਾਲੀ ਸਰਵਰ ਖੋਜ ਨੇ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਹੈ ਕਿ SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਕੇਵਲ ਦੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਢਾਂਚੇ ਹਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਇਹ ਖਾਸ 4HB ਫੋਲਡ (ਟੇਬਲ S1) ਹੈ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਡੀਪਮਾਈਂਡ (ਵਰਣਮਾਲਾ/ਗੂਗਲ) ਨੇ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਨਿਊਰਲ ਨੈੱਟਵਰਕ ਅਧਾਰਤ ਸਿਸਟਮ ਜੋ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕ੍ਰਮ 48 ਤੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ 3D ਢਾਂਚੇ ਦਾ ਸਹੀ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਦੁਆਰਾ SPACA6 ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਥੋੜ੍ਹੀ ਦੇਰ ਬਾਅਦ, ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਡੇਟਾਬੇਸ ਜਾਰੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ 48,49 ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ 98.5% ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਮਾਡਲ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਸੁਲਝੇ ਹੋਏ SPACA6 ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਇੱਕ ਖੋਜ ਮਾਡਲ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ, ਅਲਫ਼ਾਫੋਲਡ ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਵਿੱਚ ਮਾਡਲ ਲਈ ਇੱਕ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਰੂਪ ਖੋਜ ਨੇ SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਨਾਲ ਸੰਭਾਵਿਤ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ।SPACA6 (Fig. S10a) - ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਾਡੇ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਢਾਂਚੇ (Fig. S10b) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ 1.1 Å rms ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਦੀ ਅਦੁੱਤੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੇ ਮੱਦੇਨਜ਼ਰ - ਅਸੀਂ ਭਰੋਸਾ ਰੱਖ ਸਕਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪਛਾਣੇ ਗਏ SPACA6 ਮੈਚਾਂ ਦੇ ਸਹੀ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ।
ਪਹਿਲਾਂ, PSI-BLAST ਨੇ ਤਿੰਨ ਹੋਰ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ-ਸਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ IZUMO1 ਕਲੱਸਟਰ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ: IZUMO2, IZUMO3, ਅਤੇ IZUMO450।ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਨੇ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ ਇਹ IZUMO ਪਰਿਵਾਰਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 4HB ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ IZUMO1 (ਅੰਕੜੇ 3a ਅਤੇ S11) ਦੇ ਸਮਾਨ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਪੈਟਰਨ ਨਾਲ ਫੋਲਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ।ਇਹ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ IZUMO2 ਅਤੇ IZUMO3 IZUMO1 ਦੇ ਸਮਾਨ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ IZUMO4 secreted ਜਾਪਦਾ ਹੈ।ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿੱਚ IZUMO 2, 3, ਅਤੇ 4 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਕਾਰਜ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।IZUMO3 ਨੂੰ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਵਿਕਾਸ51 ਦੌਰਾਨ ਐਕਰੋਸੋਮ ਬਾਇਓਜੇਨੇਸਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਣ ਲਈ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ IZUMO ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੱਕ ਕੰਪਲੈਕਸ50 ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ, ਸੱਪਾਂ, ਅਤੇ ਉਭੀਬੀਆਂ ਵਿੱਚ IZUMO ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸੰਭਾਲ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਜ ਹੋਰ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਗੇਮੇਟ-ਫਿਊਜ਼ਨ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ DCST1/2, SOF1, ਅਤੇ FIMP ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ।
IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਡੋਮੇਨ ਆਰਕੀਟੈਕਚਰ ਦਾ ਚਿੱਤਰ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਸੰਤਰੀ, ਹਰੇ ਅਤੇ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤੇ 4HB, ਹਿੰਗ, ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਨਾਲ।IZUMO4 ਦਾ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਹੈ ਜੋ ਕਾਲਾ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਠੋਸ ਅਤੇ ਬਿੰਦੀਆਂ ਵਾਲੀਆਂ ਲਾਈਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੇ ਅਤੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLF1-F1), ਅਤੇ ਅਲਫਾਫੋਲਡ 8-5 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ਪੈਨਲ A ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਉਸੇ ਰੰਗ ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਮੈਜੈਂਟਾ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।TMEM95, IZUMO2 ਅਤੇ IZUMO3 ਟਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਹੈਲੀਸ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।
IZUMO ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਉਲਟ, ਹੋਰ SPACA ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਭਾਵ, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ਅਤੇ SPACA9) ਨੂੰ SPACA6 (Fig. S12) ਤੋਂ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖਰਾ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਸਿਰਫ਼ SPACA9 ਕੋਲ 4HB ਹੈ, ਪਰ ਇਹ SPACA6 ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਮਾਨਾਂਤਰ-ਵਿਰੋਧੀ-ਸਮਾਂਤਰ ਸਥਿਤੀ ਜਾਂ ਉਹੀ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਹੋਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਸਿਰਫ਼ SPACA1 ਕੋਲ ਇੱਕ ਸਮਾਨ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਹੈ।ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਨੇ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ SPACA3, SPACA4 ਅਤੇ SPACA5 ਦੀ SPACA6 ਨਾਲੋਂ ਬਿਲਕੁਲ ਵੱਖਰੀ ਬਣਤਰ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, SPACA4 ਨੂੰ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਣ ਲਈ ਵੀ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ SPACA6 ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੱਦ ਤੱਕ, ਇਸ ਦੀ ਬਜਾਏ ਸ਼ੁਕਰਾਣੂ ਅਤੇ oocyte zona pellucida52 ਵਿਚਕਾਰ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
ਸਾਡੀ AlphaFold ਖੋਜ ਨੂੰ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 4HB, TMEM95 ਲਈ ਇੱਕ ਹੋਰ ਮੇਲ ਮਿਲਿਆ।TMEM95, ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, 32,33 ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ 'ਤੇ ਨਰ ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਬਾਂਝ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।TMEM95 ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂਆਂ ਵਿੱਚ ਆਮ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ, ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ, ਅਤੇ ਜ਼ੋਨ ਪੈਲੁਸੀਡਾ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕਰਨ ਅਤੇ ਅੰਡੇ ਦੀ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਸੀ, ਪਰ ਓਓਸਾਈਟ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਸੀ।ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ TMEM95 IZUMO133 ਨਾਲ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਦਰਅਸਲ, ਅਲਫਾਫੋਲਡ ਮਾਡਲ ਨੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ TMEM95 ਇੱਕ 4HB ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਦੇ ਸਮਾਨ ਜੋੜਾ CXXC ਮੋਟਿਫ ਹੈ ਅਤੇ SPACA6 (Fig. 3a ਅਤੇ S11) ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈਲੀਸ 1 ਅਤੇ 2 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਉਹੀ ਵਾਧੂ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ TMEM95 ਵਿੱਚ ਇੱਕ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ, ਇਸ ਵਿੱਚ SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਹਿੰਗ ਖੇਤਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3b) ਦੇ ਸਮਾਨ ਇੱਕ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਪੈਟਰਨ ਵਾਲਾ ਖੇਤਰ ਹੈ।ਇਸ ਖਰੜੇ ਦੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਨ ਦੇ ਸਮੇਂ, ਪ੍ਰੀਪ੍ਰਿੰਟ ਸਰਵਰ ਨੇ TMEM95 ਦੀ ਬਣਤਰ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ, AlphaFold53 ਨਤੀਜੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ।TMEM95 SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਮਿਲਦਾ ਜੁਲਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਹੀ ਉਭੀਵੀਆਂ (ਚਿੱਤਰ 4 ਅਤੇ S13) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ।
PSI-BLAST ਖੋਜ ਨੇ ਜੀਵਨ ਦੇ ਰੁੱਖ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ਅਤੇ SOF1 ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਸ਼ਾਖਾ ਬਿੰਦੂਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਦੂਰੀਆਂ ਨੂੰ ਸਕੇਲ ਲਈ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਵਿਚਕਾਰ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਸਮੁੱਚੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਸਮਾਨਤਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਉਹ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਸੰਸਥਾਪਕ ਮੈਂਬਰ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ TMEM95 ਅਤੇ IZUMO 2, 3, ਅਤੇ 4 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਮੈਂਬਰ: IZUMO1, SPACA6 ਅਤੇ TMEM95।ਕਿਉਂਕਿ ਸਿਰਫ਼ ਕੁਝ ਹੀ ਮੈਂਬਰਾਂ ਕੋਲ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਹਨ, IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ 4HB ਡੋਮੇਨ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਲਈ ਵਿਲੱਖਣ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਹਨ: 1) ਇੱਕ ਐਂਟੀ-ਪੈਰਲਲ/ਪੈਰਲਲ ਅਲਟਰਨੇਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 1) ਵਿੱਚ ਵਿਵਸਥਿਤ ਹੈਲੀਸ ਦੇ ਨਾਲ ਕੋਇਲਡ 4HB . 5a), 2) ਬੰਡਲ ਦਾ ਇੱਕ ਤਿਕੋਣਾ ਚਿਹਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਬੰਡਲ ਦੇ ਅੰਦਰ ਦੋ ਹੈਲਿਕਸ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਤੀਸਰਾ ਲੰਬਕਾਰੀ ਹੈਲਿਕਸ (ਚਿੱਤਰ ਦਾ ਮੁੱਖ ਖੇਤਰ (ਚਿੱਤਰ 5c) ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਸੀਐਕਸਐਕਸਸੀ ਮੋਟਿਫ਼, ਥਿਓਰੈਡੌਕਸਿਨ-ਵਰਗੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਕੰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ redox ਸੰਵੇਦਕ 54,55,56 ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਕਿ IST ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਮੋਟਿਫ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਆਈਸੋਮੇਰੇਸ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿੱਚ ERp57। ਭੂਮਿਕਾਵਾਂ 57,58 ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਹਨ।
IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਨੂੰ 4HB ਡੋਮੇਨ ਦੀਆਂ ਤਿੰਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ: ਸਮਾਂਤਰ ਅਤੇ ਐਂਟੀਪੈਰਲਲ ਓਰੀਐਂਟੇਸ਼ਨ, ba-ਤਿਕੋਣ ਹੈਲੀਕਲ ਬੰਡਲ ਫੇਸ, ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਬਣੀ ਇੱਕ ca CXXC ਡਬਲ ਮੋਟਿਫ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਚਾਰ ਹੈਲੀਸ ਬਦਲਦੇ ਹੋਏ।) ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਹੈਲਿਕਸ (ਸੰਤਰੀ) ਅਤੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ β-ਹੇਅਰਪਿਨ (ਹਰਾ)।
SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇ ਮੱਦੇਨਜ਼ਰ, IZUMO1 ਜਾਂ JUNO ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਲਈ ਸਾਬਕਾ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਬਾਇਓਲੇਅਰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਮੈਟਰੀ (BLI) ਇੱਕ ਗਤੀ-ਆਧਾਰਿਤ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ IZUMO1 ਅਤੇ JUNO ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।IZUMO1 ਦੇ ਨਾਲ ਬਾਇਓਟਿਨ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਸੰਵੇਦਕ ਨੂੰ ਜੂਨੋ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕ ਦੀ ਇੱਕ ਉੱਚ ਤਵੱਜੋ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਦਾਣਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਸਿਗਨਲ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (Fig. S14a), ਸੈਂਸਰ ਟਿਪ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਬਾਇਓਮੈਟਰੀਅਲ ਦੀ ਮੋਟਾਈ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬਾਈਡਿੰਗ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਤਬਦੀਲੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਮਿਲਦੇ-ਜੁਲਦੇ ਸਿਗਨਲ (ਭਾਵ, ਜੂਨੋ IZUMO1 ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਇੱਕ ਦਾਣਾ ਵਜੋਂ ਸੈਂਸਰ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ) (ਚਿੱਤਰ S14b)।ਜਦੋਂ SPACA6 ਨੂੰ ਸੈਂਸਰ-ਬਾਊਂਡ IZUMO1 ਜਾਂ ਸੈਂਸਰ-ਬਾਊਂਡ JUNO (ਚਿੱਤਰ S14a,b) ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਕੋਈ ਸੰਕੇਤ ਨਹੀਂ ਮਿਲਿਆ।ਇਸ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ SPACA6 ਦਾ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ IZUMO1 ਜਾਂ JUNO ਦੇ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਕਿਉਂਕਿ BLI ਪਰਖ ਦਾਣਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 'ਤੇ ਮੁਫਤ ਲਾਈਸਿਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਬਾਇਓਟਿਨਿਲੇਸ਼ਨ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ, ਇਹ ਸੋਧ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜੇਕਰ ਲਾਈਸਿਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸੈਂਸਰ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਸਟੀਰਿਕ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ SPACA6, IZUMO1 ਅਤੇ JUNO ectodomains 'ਤੇ ਰਵਾਇਤੀ ਪੁੱਲ-ਡਾਊਨ ਅਸੈਸ ਵੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, SPACA6 ਨੇ ਹਿਜ਼-ਟੈਗ ਕੀਤੇ IZUMO1 ਜਾਂ ਹਿਜ਼-ਟੈਗਡ ਜੂਨੋ (Fig. S14c,d) ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਕਿ BLI ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਨਾਲ ਕੋਈ ਮੇਲ-ਮਿਲਾਪ ਨਹੀਂ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ JUNO ਦੇ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ His IZUMO1 (ਅੰਕੜੇ S14e ਅਤੇ S15) ਦੇ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ।
SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਵਿਚਕਾਰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, JUNO ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਲਈ SPACA6 ਦੀ ਅਸਮਰੱਥਾ ਹੈਰਾਨੀ ਵਾਲੀ ਗੱਲ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਮਨੁੱਖੀ IZUMO1 ਦੀ ਸਤਹ ਵਿੱਚ 20 ਤੋਂ ਵੱਧ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹਨ ਜੋ ਜੂਨੋ ਨਾਲ ਅੰਤਰਕਿਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਹਰੇਕ ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ (ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹਨ) (ਚਿੱਤਰ S14f)।ਇਹਨਾਂ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਵਿੱਚੋਂ, ਕੇਵਲ ਇੱਕ SPACA6 (Glu70) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਬਦਲਾਂ ਨੇ ਆਪਣੇ ਮੂਲ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ, IZUMO1 ਵਿੱਚ ਜ਼ਰੂਰੀ Arg160 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ SPACA6 ਵਿੱਚ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ Asp148 ਦੁਆਰਾ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ;ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ IZUMO1 ਵਿੱਚ Arg160Glu ਪਰਿਵਰਤਨ ਲਗਭਗ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ JUNO43 ਲਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, IZUMO1 ਅਤੇ SPACA6 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਡੋਮੇਨ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਨੇ SPACA6 (Fig. S14g) 'ਤੇ ਬਰਾਬਰ ਦੇ ਖੇਤਰ ਦੇ ਜੂਨੋ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਦੇ ਸਤਹ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।
ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ SPACA6 ਦੀ ਜਾਣੀ-ਪਛਾਣੀ ਲੋੜ ਅਤੇ IZUMO1 ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, SPACA6 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਮਾਨ JUNO ਬਾਈਡਿੰਗ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਜਾਪਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਹੱਤਵ ਦੇ ਸਬੂਤ ਦੇ ਨਾਲ ਸਾਡੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ ਹੈ।SPACA6 ਹੋਮੋਲੋਗਸ ਦੀ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ ਤੋਂ ਪਰੇ ਸਾਂਝੀ ਬਣਤਰ ਦੀ ਸੰਭਾਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਸਿਸਟੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੂਰ-ਸੰਬੰਧੀ ਉਭੀਬੀਆਂ (ਚਿੱਤਰ 6a) ਵਿੱਚ ਵੀ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ConSurf ਸਰਵਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, 66 ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੇ ਮਲਟੀਪਲ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਰੀਟੈਨਸ਼ਨ ਡੇਟਾ ਨੂੰ SPACA6 ਸਤਹ 'ਤੇ ਮੈਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਕਿਸਮ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇਹ ਦਿਖਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਦੌਰਾਨ ਕਿਹੜੀਆਂ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦਆਂ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕਿਹੜੇ ਸਤਹ ਖੇਤਰ ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੇ ਹਨ।
CLUSTAL OMEGA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀਆਂ 12 ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਤੋਂ SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ।ConSurf ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਸਭ ਤੋਂ ਰੂੜ੍ਹੀਵਾਦੀ ਅਹੁਦਿਆਂ ਨੂੰ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਸਿਸਟੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਡੋਮੇਨ ਦੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੇ ਤੱਤ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਦੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ, ਜਿੱਥੇ ਤੀਰ β-ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਤਰੰਗਾਂ ਹੈਲੀਸ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਾਲੇ NCBI ਐਕਸੈਸ ਆਈਡੈਂਟੀਫਾਇਰ ਹਨ: ਮਨੁੱਖੀ (ਹੋਮੋ ਸੈਪੀਅਨਜ਼, NP_001303901), ਮੈਂਡਰਿਲ (ਮੈਂਡਰਿਲਸ ਲਿਊਕੋਫੇਅਸ, XP_011821277), ਕੈਪੂਚਿਨ ਬਾਂਦਰ (ਸੇਬਸ ਮਿਮਿਕ, XP_0173599, XP_0173599, ca2036, ਹਾਰਸ 2036), ਕੈਪਚਿਨ ਬਾਂਦਰ ਵ੍ਹੇਲ (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), ਭੇਡ (Ovis aries, XP_014955560), ਹਾਥੀ (Loxodonta africana, XP_010585293), ਕੁੱਤਾ (Canis lupus familyis, XP_025277208), ਮਾਊਸ (Mus musculus, NP_001155560), ਟੌਸਡੋਂਟਾ (XP_00155560) 611, XP_0318), ਪਲੈਟਿਪਸ, 8) , 61_89 ਅਤੇ Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113)।ਨੰਬਰਿੰਗ ਮਨੁੱਖੀ ਕ੍ਰਮ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਹੈ.b ਸਿਖਰ 'ਤੇ 4HB ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਨਾਲ SPACA6 ਢਾਂਚੇ ਦੀ ਸਤਹ ਦੀ ਨੁਮਾਇੰਦਗੀ, ConSurf ਸਰਵਰ ਤੋਂ ਬਚਾਅ ਅਨੁਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਰੰਗ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਿੱਸੇ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਹਨ, ਮੱਧਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਿੱਸੇ ਸਫੈਦ ਵਿੱਚ ਹਨ, ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਿੱਸੇ ਪੀਲੇ ਵਿੱਚ ਹਨ।ਜਾਮਨੀ ਸਿਸਟੀਨ.ਇਨਸੈੱਟ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪੈਚ 1, 2 ਅਤੇ 3 ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਆ ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਤਿੰਨ ਸਤਹ ਪੈਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। ਇੱਕ 4HB ਕਾਰਟੂਨ ਉੱਪਰ ਸੱਜੇ ਪਾਸੇ ਇਨਸੈੱਟ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (ਇੱਕੋ ਰੰਗ ਸਕੀਮ)।
SPACA6 ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਉੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸਤਹ ਖੇਤਰ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 6b)।ਪੈਚ 1 4HB ਅਤੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਫੈਲਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸੁਰੱਖਿਅਤ CXXC ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬ੍ਰਿਜ, ਇੱਕ Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ਹਿੰਗ ਨੈੱਟਵਰਕ (Fig. S7), ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਬਾਹਰੀ ਖੁਸ਼ਬੂਦਾਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (Phe31, Tyr137, Phe31) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ (Fig. S6e) ਦਾ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਰਿਮ, ਜੋ ਕਿ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਕਈ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਇਸ ਪੈਚ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਐਪੀਟੋਪ ਹੈ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ SPACA6 30 ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਦੇਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਖੇਤਰ 3 ਕਬਜੇ ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਇੱਕ ਪਾਸੇ ਨੂੰ ਫੈਲਾਉਂਦਾ ਹੈ;ਇਸ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ਅਤੇ ਬਾਹਰ ਵੱਲ ਮੂੰਹ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਧਰੁਵੀ/ਚਾਰਜਡ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, 4HB ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 6b), ਹਾਲਾਂਕਿ ਫੋਲਡ ਨੂੰ SPACA6 ਸਮਰੂਪ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਬੰਡਲ ਕੋਰ ਦੇ ਰੂੜ੍ਹੀਵਾਦ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ) ਅਤੇ IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਤੋਂ ਪਰੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ SPACA6 ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਖੋਜਣਯੋਗ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਤੱਤਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਛੋਟਾ ਖੇਤਰ ਹੈ, ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਕਬਜੇ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ (ਖੇਤਰ 3 ਸਮੇਤ) SPACA6 ਸਮਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਨ, ਜੋ ਇਹ ਸੰਕੇਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ ਕਿ ਹੈਲੀਕਲ ਬੰਡਲ ਅਤੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ.ਹਾਲਾਂਕਿ, SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਦੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬੰਧਨ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਨੈੱਟਵਰਕਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, IZUMO137,43,44 ਦੇ ਮਲਟੀਪਲ ਮਨਜ਼ੂਰ ਸੰਰਚਨਾਵਾਂ ਦੇ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਲਚਕਤਾ ਦੇ ਸਬੂਤ ਦੇਖੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਓਵਰਲੈਪ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਪਰ ਕੇਂਦਰੀ ਧੁਰੇ ਤੋਂ 50° ਤੋਂ 70° ਤੱਕ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ (ਚਿੱਤਰ S16) ਤੱਕ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹੈ।ਹੱਲ ਵਿੱਚ SPACA6 ਦੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ, SAXS ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (Fig. S17a,b)।SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੁਨਰ-ਨਿਰਮਾਣ ਇੱਕ ਰਾਡ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਢਾਂਚੇ (ਚਿੱਤਰ S18) ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਕ੍ਰੈਟਕੀ ਪਲਾਟ ਨੇ ਕੁਝ ਹੱਦ ਤੱਕ ਲਚਕਤਾ ਦਿਖਾਈ ਹੈ (Fig. S17b)।ਇਹ ਸੰਰਚਨਾ IZUMO1 ਨਾਲ ਵਿਪਰੀਤ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਨਬਾਉਂਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਲੀ ਅਤੇ ਘੋਲ 43 ਦੋਵਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬੂਮਰੈਂਗ ਸ਼ਕਲ ਧਾਰਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਚਕਦਾਰ ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ-ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (H-DXMS) SPACA6 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ IZUMO143 (Fig. 7a,b) 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।SPACA6 ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ IZUMO1 ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਲਚਕਦਾਰ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ 100,000 s ਐਕਸਚੇਂਜ ਦੇ ਬਾਅਦ ਪੂਰੇ ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਹੈ।ਦੋਵਾਂ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ, ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਦਾ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿੱਸਾ ਉੱਚ ਪੱਧਰੀ ਐਕਸਚੇਂਜ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ 4HB ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਸੀਮਤ ਰੋਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, SPACA6 ਕਬਜੇ ਦਾ C-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿੱਸਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 147CDLPLDCP154 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਖੇਤਰ 3 (ਚਿੱਤਰ 6b), ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇੰਟਰਡੋਮੇਨ ਲਚਕਤਾ SPACA6 ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ।ਲਚਕਤਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, CD ਥਰਮਲ ਮੈਲਟ ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e ਅਤੇ S19) ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਸਥਿਰ ਹੈ।
SPACA6 ਅਤੇ b IZUMO1 ਦੇ ਇੱਕ H-DXMS ਚਿੱਤਰ।ਦਰਸਾਏ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ-ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਦੇ ਪੱਧਰ ਨੀਲੇ (10%) ਤੋਂ ਲਾਲ (90%) ਤੱਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸਕੇਲ 'ਤੇ ਰੰਗ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਬਲੈਕ ਬਾਕਸ ਉੱਚ ਮੁਦਰਾ ਦੇ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਵੇਖੀਆਂ ਗਈਆਂ 4HB, ਹਿੰਗ ਅਤੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਦੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਉੱਪਰ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।10 s, 1000 s, ਅਤੇ 100,000 s 'ਤੇ ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਦੀਆਂ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਅਣੂ ਸਤਹਾਂ 'ਤੇ ਉੱਚਿਤ ਸਟ੍ਰਿਪ ਚਾਰਟ 'ਤੇ ਪਲਾਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡਿਊਟੇਰੀਅਮ ਐਕਸਚੇਂਜ ਪੱਧਰ 50% ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ ਵਾਲੇ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਚਿੱਟੇ ਰੰਗ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।50% H-DXMS ਐਕਸਚੇਂਜ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸਕੇਲ ਵਿੱਚ ਰੰਗੀਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
CRISPR/Cas9 ਅਤੇ ਮਾਊਸ ਜੀਨ ਨਾਕਆਉਟ ਜੈਨੇਟਿਕ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੇ ਸ਼ੁਕਰਾਣੂ ਅਤੇ ਅੰਡੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਈ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।IZUMO1-JUNO ਅਤੇ CD9 ਬਣਤਰ ਦੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੁਪਤ ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ।SPACA6 ਦਾ ਬਾਇਓਫਿਜ਼ੀਕਲ ਅਤੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਗੁਣ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਅਡੈਸ਼ਨ/ਫਿਊਜ਼ਨ ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਪਹੇਲੀ ਦਾ ਇੱਕ ਹੋਰ ਹਿੱਸਾ ਹੈ।
SPACA6 ਅਤੇ IST ਦੇ ਹੋਰ ਮੈਂਬਰ ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਪੰਛੀਆਂ, ਸੱਪਾਂ, ਅਤੇ ਉਭੀਬੀਆਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ;ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਸੋਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਜ਼ੈਬਰਾਫਿਸ਼ 59 ਵਿੱਚ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵੀ SPACA6 ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ। ਇਹ ਵੰਡ ਹੋਰ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ DCST134, DCST234, FIMP31, ਅਤੇ SOF132 ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਕਾਰਕ HAP2-ਘਾਟ ਹਨ (ਵੀ GCS1) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟਿਸਟਾਂ ਦੀ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।, ਪੌਦੇ ਅਤੇ ਆਰਥਰੋਪੋਡਸ।ਫਰਟੀਲਾਈਜ਼ਡ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 60, 61. SPACA6 ਅਤੇ IZUMO1 ਵਿਚਕਾਰ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​​​ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕਿਸੇ ਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਨਾਕਆਊਟ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਨਰ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਬਾਂਝਪਨ ਪੈਦਾ ਹੋਇਆ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਕਾਰਜ ਡੁਪਲੀਕੇਟ ਨਹੀਂ ਹਨ।.ਵਧੇਰੇ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਫਿਊਜ਼ਨ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਪੜਾਅ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚੋਂ ਕੋਈ ਵੀ ਬੇਲੋੜਾ ਨਹੀਂ ਹੈ।
ਇਹ ਇੱਕ ਖੁੱਲਾ ਸਵਾਲ ਬਣਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਕਿ ਕੀ SPACA6 (ਅਤੇ IST ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਹੋਰ ਮੈਂਬਰ) ਇੰਟਰਗੈਮੈਟਿਕ ਜੰਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਹਿੱਸਾ ਲੈਂਦੇ ਹਨ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪੁਆਇੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਭਰਤੀ ਕਰਨ ਲਈ ਇੰਟਰਾਗੈਮੈਟਿਕ ਨੈਟਵਰਕ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਾਂ ਸ਼ਾਇਦ ਇਲੀਸਿਵ ਫਿਊਸੋਜਨਾਂ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।HEK293T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਪੂਰੀ ਲੰਬਾਈ IZUMO1 ਅਤੇ SPACA632 ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਡੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਨੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰੈਕਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨੋਡਾ ਐਟ ਅਲ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ.ਦੋਵਾਂ ਨੂੰ ਨਿਰਮਾਣ ਵਿੱਚ ਮਿਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (IZUMO1 ਦੀ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਪੂਛ ਨੂੰ ਨੋਟ ਕਰੋ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਗਰੱਭਧਾਰਣ ਕਰਨ ਲਈ ਬੇਲੋੜਾ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ)।ਵਿਕਲਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, IZUMO1 ਅਤੇ/ਜਾਂ SPACA6 ਨੂੰ ਖਾਸ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਾਤਾਵਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜੋ ਅਸੀਂ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਰੀਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖਾਸ ਰੂਪਾਂ ਜਾਂ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਲੇ ਅਣੂ ਕੰਪਲੈਕਸ (ਜਾਣਿਆ ਜਾਂ ਅਜੇ ਤੱਕ ਖੋਜਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ)।ਹਾਲਾਂਕਿ IZUMO1 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਪੈਰੀਵਿਟਲਾਈਨ ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਅੰਡੇ ਨਾਲ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂਜੋਆ ਦੇ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਲਈ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਅਸਪਸ਼ਟ ਹੈ।
SPACA6 ਦੀ ਬਣਤਰ ਕਈ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸਤਹਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।ਸੀਐਕਸਐਕਸਸੀ ਮੋਟਿਫ (ਉਪਰੋਕਤ ਪੈਚ 1) ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਹਿੰਗ ਖੇਤਰ ਦੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਕਈ ਬਾਹਰੀ-ਸਾਹਮਣੇ ਵਾਲੇ ਖੁਸ਼ਬੂਦਾਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹਨ ਜੋ ਅਕਸਰ ਬਾਇਓਮੋਲੀਕਿਊਲਜ਼ ਵਿਚਕਾਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਤੇ π-ਸਟੈਕਿੰਗ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ (ਖੇਤਰ 2) ਦੇ ਚੌੜੇ ਪਾਸੇ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਆਰਗ ਅਤੇ ਉਸਦੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਵਾਲਾ ਗਰੋਵ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਖੇਤਰ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਪਹਿਲਾਂ ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ 30 ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਹਨ।ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਰੇਖਿਕ ਐਪੀਟੋਪ 212RIRPAQLTHRGTFS225 ਨੂੰ ਮਾਨਤਾ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਛੇ ਵਿੱਚੋਂ ਤਿੰਨ ਆਰਜੀਨਾਈਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹਨ ਅਤੇ ਹਿਸ220 ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਇਹਨਾਂ ਖਾਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਜਾਂ ਪੂਰੇ ਖੇਤਰ ਦੀ ਰੁਕਾਵਟ ਕਾਰਨ ਹੈ।β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਦੇ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ ਦੇ ਨੇੜੇ ਇਸ ਪਾੜੇ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਗੁਆਂਢੀ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਸੀਆਈਐਸ-ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਓਓਸਾਈਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਨਹੀਂ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹਿੰਗ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਲਚਕਦਾਰ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ-ਅਮੀਰ ਟੈਂਗਲ (ਸਾਈਟ 3) ਦੀ ਧਾਰਨਾ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਸਾਈਟ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜਾਂ, ਵਧੇਰੇ ਸੰਭਾਵਨਾ, ਦੋ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਲਚਕਤਾ ਦੀ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।SPACA6 ਦੀ ਅਗਿਆਤ ਭੂਮਿਕਾ ਲਈ ਲਿੰਗ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਗੇਮੇਟਸ ਦਾ ਸੰਯੋਜਨ.
SPACA6 ਵਿੱਚ ਇੰਟਰਸੈਲੂਲਰ ਅਡੈਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਆਈਜੀ-ਵਰਗੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਚਿਪਕਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਕੈਡਰਿਨ, ਇੰਟੀਗ੍ਰੀਨ, ਐਡੇਸਿਨ, ਅਤੇ IZUMO1) ਕੋਲ ਇੱਕ ਜਾਂ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ β-ਸੈਂਡਵਿਚ ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਤੋਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵਾਤਾਵਰਣ ਦੇ ਟੀਚਿਆਂ ਤੱਕ ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਦੇ ਹਨ 63,64,65।SPACA6 ਦੇ Ig-ਵਰਗੇ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨਮੂਨਾ ਵੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ β-ਸੈਂਡਵਿਚਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ: β-ਸੈਂਡਵਿਚਾਂ ਦੇ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਤਾਰਾਂ ਦੇ ਡਬਲਟਸ, ਜਿਸਨੂੰ ਮਕੈਨੀਕਲ ਕਲੈਂਪਸ 66 ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਨਮੂਨਾ ਸ਼ੀਅਰ ਬਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇੰਟਰਸੈਲੂਲਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਕੀਮਤੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਐਡੀਸਿਨ ਨਾਲ ਇਸ ਸਮਾਨਤਾ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਇਸ ਸਮੇਂ ਇਸ ਗੱਲ ਦਾ ਕੋਈ ਸਬੂਤ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ SPACA6 ਅੰਡੇ ਦੇ ਸਫੇਦ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਜੂਨੋ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਹੈ, ਅਤੇ SPACA6-ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ HEK293T ਸੈੱਲ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਇੱਥੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜ਼ੋਨ 32 ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਓਓਸਾਈਟਸ ਨਾਲ ਮੁਸ਼ਕਿਲ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਜੇਕਰ SPACA6 ਇੰਟਰਗੈਮੈਟਿਕ ਬਾਂਡ ਸਥਾਪਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹਨਾਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਪੋਸਟ-ਅਨੁਵਾਦਕ ਸੋਧਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜਾਂ ਦੂਜੇ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਬਾਅਦ ਦੀ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੇ ਸਮਰਥਨ ਵਿੱਚ, IZUMO1-ਘਾਟ ਸ਼ੁਕ੍ਰਾਣੂ oocytes ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ IZUMO1 ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਹੋਰ ਅਣੂ ਗੇਮੇਟ ਅਡੈਸ਼ਨ ਸਟੈਪ 27 ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।
ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਵਾਇਰਲ, ਸੈਲੂਲਰ, ਅਤੇ ਵਿਕਾਸ ਸੰਬੰਧੀ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਫਿਊਜ਼ੋਨ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਕਰਨ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਵਾਇਰਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਕਲਾਸ I, II ਅਤੇ III) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪੇਪਟਾਇਡ ਜਾਂ ਲੂਪ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਹੋਸਟ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।IZUMO143 ਦੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਸਿਟੀ ਮੈਪ ਅਤੇ IST ਦੀ ਬਣਤਰ (ਨਿਰਧਾਰਤ ਅਤੇ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ) ਨੇ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਜੇਕਰ IST ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਿਊਸੋਜਨ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਉਹ ਅਜਿਹਾ ਹੋਰ ਜਾਣੀਆਂ-ਪਛਾਣੀਆਂ ਉਦਾਹਰਣਾਂ ਤੋਂ ਵੱਖਰੇ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਗੇਮੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਆਈਐਸਟੀ ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਦੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਦੇ ਫੰਕਸ਼ਨ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਰਹੱਸ ਬਣੇ ਹੋਏ ਹਨ।ਸਾਡਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲਾ SPACA6 ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਅਣੂ ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਹੱਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਢਾਂਚਾ ਇਹਨਾਂ ਸਾਂਝੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧਾਂ ਅਤੇ ਗੇਮੇਟ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਬਾਰੇ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰੇਗਾ।
ਪੂਰਵ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਮਨੁੱਖੀ SPACA6 ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ (NCBI ਐਕਸੈਸ਼ਨ ਨੰਬਰ NP_001303901.1; ਅਵਸ਼ੇਸ਼ 27-246) ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਡਰੋਸੋਫਿਲਾ ਮੇਲਾਨੋਗੈਸਟਰ S2 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਲਈ ਕੋਡੋਨ-ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਜੀਨ ਥੀਕੋਸਿਕਨੋਜ਼ੈਕਜੈਂਸ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਜੀਨ ਥੀਕੋਸਕੋਜ਼ਮਿਕ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।, BiP secretion ਸਿਗਨਲ ਅਤੇ ਅਨੁਸਾਰੀ 5′ ਅਤੇ 3′ ਇਸ ਜੀਨ ਦੇ ligation-ਸੁਤੰਤਰ ਕਲੋਨਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ pMT ਸਮੀਕਰਨ ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੈਟਾਲੋਥਿਓਨਿਨ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਪਰੋਮਾਈਸਿਨ (pMT-puro) ਨਾਲ ਚੋਣ ਲਈ ਸੋਧਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।pMT-puro ਵੈਕਟਰ ਇੱਕ ਥ੍ਰੋਮਬਿਨ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ 10x-ਹਿਜ਼ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਟੈਗ (ਚਿੱਤਰ S2) ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
SPACA6 pMT-puro ਵੈਕਟਰ ਦਾ D. melanogaster S2 (Gibco) ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ IZUMO1 ਅਤੇ JUNO43 ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਵਾਂਗ ਹੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।S2 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਨਾਈਡਰ ਦੇ ਮਾਧਿਅਮ (Gibco) ਵਿੱਚ 10% (v/v) ਹੀਟ-ਇਨਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਫੈਟਲ ਕੈਲਫ ਸੀਰਮ (Gibco) ਅਤੇ 1X ਐਂਟੀਮਾਈਕੋਟਿਕ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕ (ਗਿਬਕੋ) ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਵਿੱਚ ਪਿਘਲਾ ਕੇ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਬੀਤਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲ (3.0 x 106 ਸੈੱਲ) 6-ਖੂਹ ਵਾਲੀਆਂ ਪਲੇਟਾਂ (ਕੋਰਨਿੰਗ) ਦੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਖੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਪਲੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।27°C 'ਤੇ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ SPACA6 pMT-puro ਵੈਕਟਰ ਅਤੇ Effectene transfection reagent (Qiagen) ਦੇ 2 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਦੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਟਡ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 6 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ / ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪਿਊਰੋਮਾਈਸਿਨ ਨਾਲ ਕਟਾਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਫਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਨਾਈਡਰ ਦੇ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਧਿਅਮ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਸੀਰਮ ਮੁਕਤ ਕੀਟ-ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਮਾਧਿਅਮ (ਲੋਂਜ਼ਾ) ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ।S2 ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਦੇ ਇੱਕ 1 ਐਲ ਬੈਚ ਨੂੰ 8-10 × 106 ml-1 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ 2 L ਹਵਾਦਾਰ ਫਲੈਟ-ਤਲ ਵਾਲੇ ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਪਾਈਲੀਨ ਅਰਲੇਨਮੇਅਰ ਫਲਾਸਕ ਵਿੱਚ ਉਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 500 µM CuSO4 (ਮਿਲੀਪੋਰ ਸਿਗਮਾ) ਅਤੇ ਨਿਰਜੀਵ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਾਲ ਨਿਰਜੀਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੇਰਿਤ.ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਚਾਰ ਦਿਨਾਂ ਲਈ 120 rpm 'ਤੇ 27° C. 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
SPACA6 ਵਾਲੇ ਕੰਡੀਸ਼ਨਡ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 5660×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 10 kDa MWCO ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਨਾਲ ਸੈਂਟਰਮੇਟ ਟੈਂਜੈਂਸ਼ੀਅਲ ਫਲੋ ਫਿਲਟਰੇਸ਼ਨ ਸਿਸਟਮ (ਪਾਲ ਕਾਰਪ) ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।SPACA6 ਵਾਲੇ ਸੰਘਣੇ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ 2 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਨੀ-ਐਨਟੀਏ ਐਗਰੋਜ਼ ਰੈਜ਼ਿਨ (ਕਿਆਗੇਨ) ਕਾਲਮ ਵਿੱਚ ਲਾਗੂ ਕਰੋ।Ni-NTA ਰਾਲ ਨੂੰ ਬਫਰ A ਦੇ 10 ਕਾਲਮ ਵਾਲੀਅਮ (CV) ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ 50 mM ਦੀ ਅੰਤਮ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇਣ ਲਈ ਬਫਰ A ਦਾ 1 CV ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ।SPACA6 ਨੂੰ 10 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਬਫਰ ਏ ਨਾਲ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ ਨਾਲ ਪੂਰਕ 500 ਮਿ.ਮੀ. ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡਾਇਲਸਿਸ ਟਿਊਬਿੰਗ (MWCO 12-14 kDa) ਵਿੱਚ 1 ਯੂਨਿਟ ਪ੍ਰਤੀ mg SPACA6 ਬਨਾਮ 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ਅਤੇ 150 mM NaCl (ਬਫਰ ਬੀ) ਲਈ ਡਾਇਲਸਿਸ ਟਿਊਬਿੰਗ (MWCO 12-14 kDa) ਵਿੱਚ ਪਾਬੰਦੀ ਕਲਾਸ ਥ੍ਰੋਮਬਿਨ (ਮਿਲੀਪੋਰ ਸਿਗਮਾ) ਨੂੰ ਸਿੱਧਾ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।48 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 4°C 'ਤੇ।ਥ੍ਰੋਮਬਿਨ-ਕਲੀਵਡ SPACA6 ਨੂੰ ਫਿਰ ਲੂਣ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾ ਪੇਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 ਨਾਲ ਸੰਤੁਲਿਤ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਮੋਨੋਐਸ 5/50 GL ਕੈਸ਼ਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਕਾਲਮ (ਸਾਇਟੀਵਾ/GE) ਉੱਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੈਸ਼ਨ ਐਕਸਚੇਂਜਰ ਨੂੰ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ਦੇ 3 CV ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ SPACA6 ਨੂੰ 25 CV ਲਈ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ਵਿੱਚ 0 ਤੋਂ 500 mM NaCl ਦੇ ਰੇਖਿਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਅਲੋਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਆਇਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, SPACA6 ਨੂੰ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਤੱਕ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ENrich SEC650 10 x 300 ਕਾਲਮ (BioRad) ਤੋਂ ਬਫਰ B ਨਾਲ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗਰਾਮ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, SPACA6 ਵਾਲੇ ਪੂਲ ਅਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਭਿੰਨਾਂ।ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ 16% SDS-polyacrylamide ਜੈੱਲ 'ਤੇ Coomassie-stained electrophoresis ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਬੀਅਰ-ਲੈਂਬਰਟ ਕਾਨੂੰਨ ਅਤੇ ਸਿਧਾਂਤਕ ਮੋਲਰ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਗੁਣਾਂਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 280 nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸ਼ੁੱਧ SPACA6 ਨੂੰ 10 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ, pH 7.4 ਅਤੇ 150 mM NaF ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਡਾਇਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ CD ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 0.16 mg/mL ਤੱਕ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।185 ਤੋਂ 260 nm ਦੀ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੀ ਸੀਡੀ ਦੀ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਸਕੈਨਿੰਗ ਨੂੰ 50 nm/ਮਿੰਟ ਦੀ ਦਰ ਨਾਲ 25 °C 'ਤੇ 1 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਆਪਟੀਕਲ ਪਾਥ ਲੰਬਾਈ (ਹੇਲਮਾ) ਦੇ ਨਾਲ ਕੁਆਰਟਜ਼ ਕਿਊਵੇਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੈਸਕੋ ਜੇ-1500 ਸਪੈਕਟਰੋਪੋਲਾਰੀਮੀਟਰ 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੀਡੀ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਬੇਸਲਾਈਨ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, 10 ਤੋਂ ਵੱਧ ਪ੍ਰਾਪਤੀਆਂ ਦੀ ਔਸਤ, ਅਤੇ ਡਿਗਰੀ cm2/dmol ਵਿੱਚ ਬਕਾਇਆ ਅੰਡਾਕਾਰਤਾ (θMRE) ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ:
ਜਿੱਥੇ MW Da ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਅਣੂ ਭਾਰ ਹੈ;N ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਹੈ;θ ਮਿਲੀਡਿਗਰੀ ਵਿੱਚ ਅੰਡਾਕਾਰਤਾ ਹੈ;d cm ਵਿੱਚ ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਗ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ;ਇਕਾਈਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਤਵੱਜੋ.