310 10*1mm ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਿੰਗ ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪੋਨੈਂਟ, ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਥਿਰਤਾ ਲਈ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।

Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਪ੍ਰਤੀ ਸਲਾਈਡ ਤਿੰਨ ਲੇਖ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਸਲਾਈਡਰ।ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਪਿੱਛੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਹਰ ਇੱਕ ਸਲਾਈਡ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡ ਕੰਟਰੋਲਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।

ਨਿਰਧਾਰਨ

310 10*1mm ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਿੰਗ ਸਪਲਾਇਰ

ਰਸਾਇਣਕ ਰਚਨਾ

ਮਕੈਨੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ

ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡਰ ਸਿਲਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਸਪਾਈਡਰ ਸਿਲਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਦੇ ਨਵੇਂ ਬਾਇਓਮਟੀਰੀਅਲਜ਼ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਸੰਭਾਵੀ ਉਪਯੋਗ ਹਨ, ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮਲਟੀਮੋਡਲ ਅਤੇ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ-ਪ੍ਰੋਨ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਔਖਾ ਅਤੇ ਵਰਤੋਂ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਕ ਛੋਟੇ ਸਪਾਈਡਰੋਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ (NT) ਆਪਣੇ ਆਪ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸਵੈ-ਸਹਾਇਕ ਅਤੇ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।NT ਅਤੇ ਗ੍ਰੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ ਪਿਊਰੀਨ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਜ਼ ਵਾਲੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ.ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ NT ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉੱਚ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਦਾਵਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਆਕਰਸ਼ਕ ਗੁਣਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਾਰਦਰਸ਼ਤਾ, ਬਿਨਾਂ ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਦੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ, ਅਤੇ ਉੱਚ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਸਰਗਰਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਿੱਧੀ ਸਥਿਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਮੱਕੜੀਆਂ ਵਿੱਚ ਰੇਸ਼ਮ ਗ੍ਰੰਥੀਆਂ ਦੇ ਸੱਤ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈੱਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਹਰ ਇੱਕ ਖਾਸ ਕਿਸਮ ਦਾ ਰੇਸ਼ਮ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸਾਰੀਆਂ ਸੱਤ ਰੇਸ਼ਮ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਮੱਕੜੀ ਦੇ ਰੇਸ਼ਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਸਪਾਈਡਰੋਨ) ਨਾਲ ਬਣੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਲਗਭਗ 6000 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹਨ ਅਤੇ ਗੋਲਾਕਾਰ N- ਅਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨਾਂ (NT ਅਤੇ CT) 1,2 ਨਾਲ ਘਿਰਿਆ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਕੇਂਦਰੀ ਦੁਹਰਾਓ ਖੇਤਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ।ਰੇਸ਼ਮ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਕਿਸਮ, ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਪੁਲਾ, ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਪੁਲਾ ਗਲੈਂਡ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਗਲੈਂਡ ਵਿੱਚ, ਏਪੀਥੈਲੀਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਮੋਨੋਲਾਇਰ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਗਲੈਂਡ ਦੇ ਲੂਮੇਨ ਵਿੱਚ ਛੁਪਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਉਹ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (30-50% w/v) 3,4 ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਰੂਪ (ਡੋਪਿੰਗ) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਗਲੈਂਡ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਐਂਪੁਲਰ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸੰਗਠਨ ਅਤੇ ਸੰਰਚਨਾ 'ਤੇ ਬਹਿਸ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਪਰ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਬੂਤ ਇੱਕ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੈਲੀਕਲ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬ ਹੈਲੀਕਲ ਰੂਪਾਂਤਰ ਅਤੇ ਮਾਈਕਲਰ ਜਾਂ ਲੈਮੇਲਰ ਬਣਤਰ 5,6,7,8,9,10 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਡੋਮੇਨ ਰੇਸ਼ਮ ਫਾਈਬਰਾਂ ਦੀਆਂ ਮਕੈਨੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, β-ਸ਼ੀਟ ਨੈਨੋਕ੍ਰਿਸਟਲ ਅਤੇ ਅਮੋਰਫਸ ਸਟ੍ਰਕਚਰਜ਼ 11,12,13,14,15 ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅੰਤ ਡੋਮੇਨ ਰੇਸ਼ਮ ਗਲੈਂਡ 16,17,18 ਦੇ ਨਾਲ ਬਦਲਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਰੇਸ਼ਮ ਫਾਈਬਰਾਂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਰੇਸ਼ਮ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਕੇ, 19. ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਕੰਮ ਸਾਰੇ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 2,20,21 ਲਈ ਆਮ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਗਲੈਂਡ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦਾ pH ਲਗਭਗ 7.6 ਤੋਂ <5.716 ਤੱਕ ਘਟਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਸੰਕੁਚਿਤ ਨਲੀ ਦੁਆਰਾ ਹਿੱਲਣ ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਨਾਲ ਕੱਟਣ ਅਤੇ ਖਿੱਚਣ ਨਾਲ ਵਧਦਾ ਹੈ।ਘੋਲ ਵਿੱਚ, CT ਇੱਕ α-ਹੇਲੀਕਲ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਡਾਈਮਰ17 ਹੈ, ਪਰ ਘੱਟ pH ਅਤੇ ਸ਼ੀਅਰ ਬਲਾਂ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ, CT β-layers16, 17 ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਨਵਰਟ 16 ਦੇ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ β-ਪਰਤਾਂ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ। NT ਮੋਨੋਮਰਿਕ ਹਨ। ਅਜਿਹੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਜੋ ਗਲੈਂਡ ਦੇ ਲੂਮੇਨ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦੀ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਪਰ ਘੱਟ pH ਤੇ, ਕਾਰਬੋਕਸਿਲਿਕ ਐਸਿਡ ਸਾਈਡ ਚੇਨਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਸੰਖਿਆ ਦਾ ਪ੍ਰੋਟੋਨੇਸ਼ਨ ਲਗਭਗ 6.5 ਦੇ pKa ਨਾਲ NT ਦੇ ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ NT ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਨੂੰ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਮਾਤਰਾਵਾਂਨੈੱਟਵਰਕ 16,18.ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, NT ਫਿਲਾਮੈਂਟ ਬਣਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਪਰਤ ਵਿੱਚ ਮੋਨੋਮਰ ਤੋਂ ਫਾਈਬਰ23,24,25 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਡਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲਦਾ ਹੈ।NT ਮਿਤੀ 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 ਤੱਕ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਅਤੇ ਹੈਲੀਕਲ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੇ ਹੇਟਰੋਲੋਗਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਲਈ ਇੱਕ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲਤਾ-ਵਧਾਉਣ ਵਾਲੇ ਲੇਬਲ ਵਜੋਂ ਇਸਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ।
ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਮਿੰਨੀ ਸਪਾਈਡਰ ਰੇਸ਼ਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ NT, ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਦੁਹਰਾਓ ਖੇਤਰ, ਇੱਕ CT, ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ His6 ਟੈਗ (His-NT2RepCT) ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜਲਮਈ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਓਨਾ ਹੀ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹੈ ਜਿੰਨਾ ਦੇਸੀ ਮੱਕੜੀ ਰੇਸ਼ਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਰੇਸ਼ਮ ਮੱਕੜੀ ਦੀਆਂ ਮੂਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਦਾ ਹੈ। .ਕਵਰੇਜ 25.31.His-NT2RepCT ਨੂੰ ਇੱਕ ਬਾਇਓਮੀਮੈਟਿਕ ਮਸ਼ੀਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰੰਤਰ ਫਾਈਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕੱਟਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ pH 8 ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪਰਤ ਨੂੰ ਇੱਕ pH 525,32,33,34,35 ਪਾਣੀ ਦੇ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ ਕੱਢਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਈ. ਕੋਲੀ ਦਾ ਬਾਇਓਰੀਐਕਟਰ ਫਰਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਜੋ His-NT2RepCT ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ> 14 g/L ਝਾੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਹੋਇਆ।ਉੱਚ ਉਪਜ, ਉੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲਤਾ, ਅਤੇ ਤੇਜ਼ਾਬ ਵਾਲੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਲਈ His-NT2RepCT ਦਾ ਢੁਕਵਾਂ ਜਵਾਬ NT23, 25, 34 ਨੂੰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂਟੀਗਰੇਡ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੋਲ ਨੂੰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ, ਇਕੱਲੇ NT ਸਮੇਤ, ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਗਠਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਥੀਓਫਲੇਵਿਨ ਟੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ (ThT), ਫੁਰੀਅਰ ਟ੍ਰਾਂਸਫਾਰਮ ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FTIR), ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਮੈਗਨੈਟਿਕ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਸਪੈਕਟਰੋਸਕੋਪੀ (NMR) ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (TEM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ NT ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਪਾਈਡਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ β-ਸ਼ੀਟਾਂ ਅਤੇ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਫਾਈਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਹਨ। ਜਦੋਂ ਜੈੱਲ ਬਣਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, NT ਅਤੇ ਗ੍ਰੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (GFP) ਜਾਂ purine nucleoside phosphorylase (PNP) ਦੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨਾਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਹੇਟਰੋਲੋਗਸ ਮੇਜ਼ਬਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ ਸਮੀਕਰਨ, ਸਰੀਰਕ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਗਠਨ ਦੇ ਨਾਲ, ਇੰਜੀਨੀਅਰਡ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਲਾਗਤ-ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਉਤਪਾਦਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਦਾ ਹੈ।
ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 36 ਦੇ ਉਲਟ, His-NT2RepCT ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ ਬਫਰ ਵਿੱਚ pH 8 ਤੇ ਸਥਿਰ ਹੈ ਅਤੇ ਬਿਨਾਂ ਵਰਖਾ 25 ਦੇ 500 mg/mL ਤੱਕ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਜਾਣ ਕੇ ਹੈਰਾਨੀ ਹੋਈ ਕਿ ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 37°C (ਚਿੱਤਰ 1b-d) 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਆਪਟੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਪੱਸ਼ਟ, ਸਵੈ-ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਹੋਰ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ His-NT2RepCT ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (10–300 mg/mL) ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਵਾਪਰਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਸਮੇਂ (ਚਿੱਤਰ 1c ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1) ਨਾਲ ਉਲਟਾ ਸਬੰਧ ਸੀ।ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕਿ His-NT2RepCT ਦੇ ਕਿਹੜੇ ਹਿੱਸੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਗਠਨ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਫਲਾਸਕ ਇਨਵਰਸ਼ਨ ਅਸੈਸ (ਚਿੱਤਰ 1a,b) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹਰੇਕ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੰਜੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦੇ ਸਾਰੇ ਜਾਂਚੇ ਗਏ ਅੰਸ਼ਾਂ ਨੇ 1 ਘੰਟੇ ਤੋਂ ਵੀ ਘੱਟ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਜੈੱਲ ਬਣਾਏ (300 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/mL ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ), 2Rep (Fig. 1b) ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਕੱਲੇ NT ਅਤੇ CT, ਸੁਮੇਲ ਵਿੱਚ, ਜਾਂ ਦੁਹਰਾਉਣ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋਏ, 37°C 'ਤੇ ਜੈੱਲ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ His6 ਟੈਗ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਕਿਸੇ ਵੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੱਦ ਤੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ NT ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਅਤੇ ਸਥਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੀਆਂ ਪਿਛਲੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਨੇ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਅਤੇ/ਜਾਂ CTs ਵਿੱਚ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਲਈ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਠਹਿਰਾਇਆ ਹੈ, NT ਖੁਦ ਵੀ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਖੋਜ ਅਚਾਨਕ ਸੀ.ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1) 37, 38, 39. ਕਮਾਲ ਦੀ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, NT ਪਹਿਲਾਂ ਹੀ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ≥ 300 mg/mL (ਚਿੱਤਰ 1c) ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ ਜੈੱਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।NT ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਉਲਟ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ 50 mg/mL 'ਤੇ NT ਦਾ ਘੋਲ ਹਿਸ-NT2RepCT ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (w/v, ਚਿੱਤਰ 1c) 'ਤੇ ਨਿਕਲਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਪਾਈਡਰੋਇਨ ਨਿਰਮਾਣਾਂ ਦੀ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ।b ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਕੇ ਤਸਦੀਕ ਕੀਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (300 mg/mL) ਲਈ 37 °C 'ਤੇ ਜੈੱਲ ਸਮਾਂ।CT ਜੈੱਲ ਤੁਰੰਤ ਬਿਨਾਂ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm ਸਕੇਲ)।c ਹਿਸ-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਦਾ ਜੈੱਲ ਸਮਾਂ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸੰਕੇਤਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ।d ਮੱਕੜੀ ਦੇ ਨਾਲ ਹਿਸ-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੀਆਂ ਫੋਟੋਆਂ ਅਤੇ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਹੇਠਾਂ ਛਾਪੇ ਗਏ ਅੱਖਰ "NT" (ਦੋਵੇਂ 200 mg/mL, ਸਕੇਲ ਬਾਰ 5 mm)।
ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੈਲਸ ਦੇ ਰੰਗ ਥੋੜੇ ਵੱਖਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਨੰਗੀ ਅੱਖ ਦਾ ਨਿਰੀਖਣ ਪਾਰਦਰਸ਼ਤਾ ਦੀਆਂ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੀਆਂ ਡਿਗਰੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1b)।NT ਜੈੱਲ ਅਸਧਾਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਕਿ ਹੋਰ ਜੈੱਲ ਅਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਬਣ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਬੇਲਨਾਕਾਰ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁੱਟੇ ਗਏ His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਜੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਮੋਲਡ ਤੋਂ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1d)।
ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਕੁਦਰਤੀ ਮੱਕੜੀ ਦੇ ਰੇਸ਼ਮ ਦੀ ਕੋਟਿੰਗ ਜੈੱਲ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਹੁਣ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡਰੋਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ, ਪਰਤਾਂ ਨੂੰ ਸਵੀਡਿਸ਼ ਬ੍ਰਿਜ ਸਪਾਈਡਰ (ਲਾਰੀਨੀਓਇਡਜ਼ ਸਕੋਪੇਟੇਰੀਅਸ) ਦੇ ਵੱਡੇ ਐਂਪੁਲਾ ਗਲੈਂਡ ਤੋਂ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕੋਟਿੰਗਾਂ ਨੂੰ 20 mM Tris-HCl ਬਫਰ ਵਿੱਚ 50 mg/mL (ਮਾਪੇ ਗਏ ਸੁੱਕੇ ਵਜ਼ਨ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ) ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ 37 °C (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a) 'ਤੇ 21 ਦਿਨ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਦੌਰਾਨ ਕੋਈ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇਹਨਾਂ ਜੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸਮੁੱਚੀ ਮਕੈਨੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ rheological ਮਾਪਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਉੱਚੇ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਸਟੋਰੇਜ਼ ਮਾਡਿਊਲਸ (ਲਚਕੀਲੇਪਨ) ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਨਾ ਜੈਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਕੋਟਿੰਗ ਦੇ ਵਿਸਕੋਇਲੇਸਟਿਕ ਗੁਣਾਂ ਬਾਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਣ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ (ਕੁਦਰਤੀ ਰੇਸ਼ਮ ਸਟਾਕ ਹੱਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, 25-45 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 1°C/min ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ) 40,41 ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਹਿਜ਼-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਹੱਲਾਂ ਦੀ ਸਟੋਰੇਜ਼ ਮੋਡਿਊਲੀ ਵਧਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨਾਲ ਵਧੀ ਹੈ।ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3)।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, NT ਮੋਡੀਊਲ His-NT2RepCT ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵਧਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਇਆ, ਜੋ ਕਿ ਤੇਜ਼ ਜੈੱਲ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ ਜਦੋਂ NT ਨੂੰ 37°C (ਚਿੱਤਰ 1) 'ਤੇ His-NT2RepCT ਨਾਲ ਸਿੱਧਾ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਅਗਲੀ ਗਿਰਾਵਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਟੋਰੇਜ ਮਾਡਿਊਲਸ ਹੇਠਲੇ ਮੁੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਾਪਸ ਨਹੀਂ ਆਇਆ ਅਤੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੇ ਮਾਡਿਊਲਸ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਰਿਹਾ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3 ਦੇਖੋ), ਜੋ ਥਰਮਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਟੱਲ ਸਥਿਰ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 100-500 mg/mL ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ His-NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਲਈ ਅੰਤਮ ਲਚਕੀਲੇ ਮਾਡਿਊਲਸ 15 ਤੋਂ 330 kPa ਤੱਕ ਸੀ, ਅਤੇ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ (100–500 mg/mL) ਲਈ ਅੰਤਮ ਲਚਕੀਲੇ ਮਾਡਿਊਲਸ 00 ਤੋਂ 2144 ਤੱਕ ਸੀ। kPa (ਚਿੱਤਰ , 2 ਅਤੇ ਪੂਰਾ ਰੈਂਪ ਡੇਟਾ) ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3 ਵੇਖੋ)।
ਹਿੱਲਣ ਦੇ ਨਾਲ His-NT2RepCT (300 mg/mL) ਅਤੇ b NT (300 mg/mL) ਦੇ ਮਾਪ ਦੌਰਾਨ ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ।ਤੀਰ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਰੁਝਾਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਸਟੋਰੇਜ਼ ਮੋਡੀਊਲ ਡੇਟਾ ਦੀ ਹਲਕੀ ਸ਼ੇਡਿੰਗ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਦਿਸ਼ਟ ਸਾਧਨ ਲਈ ਘੱਟ ਟਾਰਕ ਮੁੱਲਾਂ 'ਤੇ ਟੈਸਟਿੰਗ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵਧੇ ਹੋਏ ਰੌਲੇ ਦਾ ਕਾਰਨ ਹੈ।c ਐਲੀਵੇਟਿਡ ਤਾਪਮਾਨ (100, 300, ਅਤੇ 500 mg/mL) ਤੋਂ ਬਾਅਦ His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਦਾ ਅੰਤ-ਮੋਡਿਊਲ ਇਕੱਤਰ ਕਰਨਾ।ਸਾਰੇ ਮੋਡੀਊਲ ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਨੂੰ 0.1 Hz ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਢੰਗ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ 37° C (ਚਿੱਤਰ 3a,b) 'ਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਦਾ FTIR ਸਪੈਕਟਰਾ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਹੱਲਾਂ ਦਾ ਸਪੈਕਟਰਾ α-helix/ਰੈਂਡਮ ਕੋਇਲ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ, 1645 cm-1 'ਤੇ ਇੱਕ ਸਪੱਸ਼ਟ ਬੈਂਡ ਦੇ ਨਾਲ।ਦੋਨਾਂ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲਾਂ ਲਈ, ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮੱਧ I ਬੈਂਡ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 1617 cm-1 ਅਤੇ 1695 cm-1 (ਚਿੱਤਰ 3a, b) ਵਿੱਚ ਦੋ ਬਾਹਾਂ ਬਣੀਆਂ, ਜੋ ਕਿ ਐਂਟੀਪੈਰਲਲ β-ਸ਼ੀਟ ਬਣਤਰਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਸਬੰਧਤ ਦੂਜੇ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਅਤੇ ਫਰਕ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟਰਾ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4b) ਵਿੱਚ ਵੀ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।NT β-ਪਰਤ ਦੇ ਦੋ ਬੈਂਡ His-NT2RepCT ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਉਚਾਰਣ ਵਾਲੇ ਸਨ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਵਿੱਚ β-ਲੇਅਰ ਬੈਂਡਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ ਸਮੱਗਰੀ NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਸੀ।
ਹਿਸ-NT2RepCT ਅਤੇ b NT (ਦੋਵੇਂ 500 mg/mL) ਦਾ ਇੱਕ FTIR ਸਮਾਈ ਸਪੈਕਟਰਾ (ਹੱਲ) ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ (ਜੈੱਲ) 37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ।c ਮੁੜ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤੇ 50 mg/ml NT2RepCT ਜੈੱਲਾਂ ਅਤੇ d NT ਦੀਆਂ TEM ਤਸਵੀਰਾਂ।ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 200 nm.e His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਫਾਈਬਰ ਵਿਆਸ।n = 100 ਮਾਪੇ ਫਾਈਬਰਿਲ, p < 0.0001।ਐਰਰ ਬਾਰ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਗਲਤੀ ਬਾਰਾਂ ਦਾ ਕੇਂਦਰ ਮੱਧਮਾਨ ਹੈ।ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ (ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ) ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।f ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (100 mg/mL) ਦਾ 37 ° C 'ਤੇ ਬਿਨਾਂ ਹਿੱਲਣ ਦੇ ThT ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ।g NT (100 mg/mL) 0%, 5%, 10%, ਅਤੇ 20% ਬੀਜਾਂ ਦੇ ਨਾਲ 100 mg/mL NT ਜੈੱਲ ਤੋਂ ਟੀਕਾਕਰਨ ਪ੍ਰਯੋਗ।
ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (TEM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੈੱਲ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੈਲ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ (ਅੰਜੀਰ 3c, 3d) ਹੁੰਦੇ ਹਨ।NT-ਗਠਿਤ ਫਾਈਬਰਿਲ ਲੰਬੇ (5–12 nm ਵਿਆਸ ਵਿੱਚ) ਅਤੇ ਅਣ-ਸ਼ਾਖਾ ਵਾਲੇ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ His-NT2RepCT ਫਾਈਬਰਲ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਅਤੇ ਵਿਆਸ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੌੜੇ ਸਨ (7-16 nm) (ਚਿੱਤਰ 3e)।ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਥੀਓਫਲੇਵਿਨ ਟੀ (ThT) ਪਰਖ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫਾਈਬਰੋਸਿਸ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ।ਸਾਰੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਵਧਿਆ ਜਦੋਂ ਨਮੂਨੇ 37 °C (ਚਿੱਤਰ 3f, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5a) 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸ ਖੋਜ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, NT ਅਤੇ His-NT2RepCT ਦੀ ਮਾਈਕਰੋਸਕੋਪਿਕ ਜਾਂਚ ਨੇ ਗੈਲਿੰਗ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ ThT-ਪਾਜ਼ਿਟਿਵ ਐਗਰੀਗੇਟਸ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5b,c) ਦੇ ਸਥਾਨਕ ਸੰਚਨ ਦੇ ਬਿਨਾਂ ThT ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਵਾਧਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ।ThT-ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਦਾ ਗਠਨ NT ਅਤੇ His-NTCT turbidity (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5d) ਵਿੱਚ ਵਾਧੇ ਦੇ ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਜਿਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਜੈੱਲ ਵਿੱਚ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਦਾ ਇੱਕ ਨੈਟਵਰਕ ਜੈੱਲ ਸਪੱਸ਼ਟਤਾ ਨਾਲ ਸਮਝੌਤਾ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਬਣ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪੂਰਵ-ਗਠਿਤ ਫਾਈਬਰਲਾਂ ਦੀ ਥੋੜ੍ਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਬੀਜਣ ਨਾਲ ਕੁਝ ਐਮੀਲੋਇਡਜ਼ 42,43,44 ਦੇ ਫਾਈਬਰਿਲ ਗਠਨ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਪਰ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਕੋਆਗੂਲੈਂਟਸ ਦੇ ਘੋਲ ਵਿੱਚ 5%, 10% ਜਾਂ 20% (w/w) NT ਜੋੜਨਾ।ਬੀਜਣ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ (ਚਿੱਤਰ 3g)।ਸ਼ਾਇਦ ਇਹ ਇਸ ਤੱਥ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ ਕਿ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਵਿਚਲੇ ਫਾਈਬਰਲ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਥਿਰ ਹਨ ਅਤੇ ਬੀਜਾਂ ਵਜੋਂ ਨਹੀਂ ਵਰਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅਚਾਨਕ ਵਿਵਹਾਰ ਨੇ ਜੈੱਲ ਦੇ ਗਠਨ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਚੁੰਬਕੀ ਗੂੰਜ (NMR) ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਆ।ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ 37°C 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ His-NT2RepCT ਹੱਲਾਂ ਦੇ NMR ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ CT ਅਜੇ ਵੀ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫੋਲਡ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ NT ਅਤੇ 2Rep ਸਿਗਨਲ ਗਾਇਬ ਹੋ ਗਏ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 4a), ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇਹ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ NT ਅਤੇ 2Rep ਸਨ ਜੋ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਿਸ- ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਦੇ ਸਨ। NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ.ਸੀਟੀ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵੀ ਇਸਦੀ ਮੂਲ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ 20% ਤੱਕ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੀਟੀ ਵੀ ਜਿਆਦਾਤਰ ਸਥਿਰ ਹੈ ਅਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਸੀਟੀ ਦੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਹਿੱਸੇ ਲਈ, ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰੀ-ਇੰਕਿਊਬੇਟਡ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਮੋਬਾਈਲ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੱਲ NMR ਦੁਆਰਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲੇ 10 ਸਟ੍ਰਕਚਰਡ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਲਈ ਸੰਕੇਤਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ, ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ His-NT2Rep ਦੇ ਜੁੜੇ ਹਿੱਸੇ ਦੇ ਮੁਸ਼ਕਲ ਸਥਿਰਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲਜ਼ ਦੀ -ਸਟੇਟ ਦੇ NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ -NT2RepCT ਨੇ α-helices ਅਤੇ β-ਪਰਤਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਅਤੇ, ਕੁਝ ਹੱਦ ਤੱਕ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਕੋਇਲ ਰੂਪਾਂਤਰ (ਚਿੱਤਰ 4b)।ਸਿਰਫ NT ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਇਹ ਡੋਮੇਨ ਇੱਕ β-ਸ਼ੀਟ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਘੋਲ ਵਿੱਚ NT ਦੇ ਸਮੇਂ-ਨਿਰਭਰ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੇ ਸਿਗਨਲ ਤੀਬਰਤਾ (Fig. 4c) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਕਮੀ ਦਿਖਾਈ, ਅਤੇ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਠੋਸ-ਸਟੇਟ NMR ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ NT ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ β-ਸ਼ੀਟ ਬਣਤਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4d) ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।2Rep ਦੀ ਸੰਰਚਨਾ ਨੂੰ ਇਸਦੀ ਸਮੁੱਚੀ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, NTCT ਅਤੇ His-NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਦਾ ਠੋਸ ਅਵਸਥਾ NMR ਸਪੈਕਟਰਾ ਬਹੁਤ ਸਮਾਨ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਸੀ (Fig. 4b; ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ Fig. 6b), ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ 2Rep ਨੇ His-NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਦੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਇਆ।ਸੀਟੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲਜ਼ ਲਈ, α-ਹੇਲੀਸੇਸ, β-ਸ਼ੀਟਾਂ, ਅਤੇ ਬੇਤਰਤੀਬ ਹੈਲੀਕਲ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਮੌਜੂਦ ਸਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6d)।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ CT ਦੇ ਕੁਝ ਹਿੱਸੇ α-helices ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੂਸਰੇ β-ਸ਼ੀਟਾਂ ਬਣ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ 2Rep ਅਤੇ CT ਦੇ ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ਨ 'ਤੇ ਇੱਕ β-ਸ਼ੀਟ ਰੂਪਾਂਤਰ ਵਿੱਚ ਵੀ ਬਦਲਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, ਅਸੀਂ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਐਮੀਲੋਇਡ ਸਪੇਸ਼ੀਅਲ ਜ਼ਿੱਪਰ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ NT ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਸਾਰੇ ਪੰਜ ਹੈਲੀਸ ਵਿੱਚ ਬਣਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਵਾਲਟਜ਼ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਨੇ ਹੈਲਿਕਸ 1 (ਚਿੱਤਰ 4e) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਐਮੀਲੋਇਡੋਜਨਿਕ ਖੇਤਰ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਹੈ।
15N-HSQC ਦਾ 2D ਸਪੈਕਟਰਾ 10 mg/mL His-NT2RepCT ਘੋਲ (ਨੀਲਾ) ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ (ਲਾਲ) ਤੋਂ 19 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ।ਲਾਲ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਕਰਾਸ ਪੀਕ ਅਤੇ ਨੀਲੇ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ F24, G136, polyA ਨੂੰ ਸਿੰਗਲ ਅੱਖਰ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਚਿੰਨ੍ਹ ਅਤੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੰਬਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਨਸੈਟਸ NT, 2Rep, ਅਤੇ CT ਡੋਮੇਨਾਂ ਤੋਂ ਚੁਣੇ ਗਏ ਖੂੰਹਦ ਲਈ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਸਿਗਨਲ ਤੀਬਰਤਾ ਦੀ ਨਿਰਭਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।b His-NT2RepCT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦਾ ਸਾਲਿਡ-ਸਟੇਟ ਰੇਡੀਓਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ (RFDR) ਸਪੈਕਟਰਾ।RFDR ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ Cα/Cβ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਸਬੰਧਾਂ ਨੂੰ ਮਾਡਲ ਪੇਪਟਾਇਡ ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਅਤੇ ਅੰਕੜਿਆਂ 82,83 ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੁੱਲਾਂ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।SSB - ਰੋਟੇਟਿੰਗ ਸਾਈਡਬੈਂਡ।c 15N-HSQC 10 mg/mL NT ਘੋਲ ਦਾ ਇੱਕ-ਅਯਾਮੀ ਸਪੈਕਟਰਾ 36 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 37 ° C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਦੌਰਾਨ।ਇਨਸੈੱਟ ਸਮੇਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਵੋਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ ਤੀਬਰਤਾ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।d NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦਾ ਠੋਸ ਅਵਸਥਾ RFDR ਸਪੈਕਟਰਾ।Cα/Cβ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਅਤੇ RFDR ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਵੇਖੀਆਂ ਗਈਆਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰਾਂ ਦੇ ਸਬੰਧਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।e ਜ਼ਿੱਪਰ ਡੇਟਾਬੇਸ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ਤੋਂ NT45.79 ਫਾਈਬਰਿਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਪੈਨਸੀਟੀ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ।ਹੈਕਸਾਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਸਥਾਨਿਕ ਬਿਜਲੀ ਦੀ ਸ਼ਿਫਟ ਵਿੰਡੋ ਦੀ ਰੋਜ਼ੇਟਾ ਊਰਜਾ kcal/mol ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।ਲਾਲ ਪੱਟੀਆਂ ਉੱਚ ਫਾਈਬਰੋਸਿਸ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਵਾਲੇ ਹੈਕਸਾਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ (ਰੋਸੇਟਾ ਊਰਜਾ -23 kcal/mol ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ; ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਦੇ ਹੇਠਾਂ)।ਹਰੀਆਂ ਪੱਟੀਆਂ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਰੋਸੇਟਾ ਊਰਜਾ ਵਾਲੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਸਟੀਰਿਕ ਜ਼ਿੱਪਰ ਬਣਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ ਵਾਲੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਬਿਨਾਂ ਕਾਲਮਾਂ ਦੇ)।ਵਰਗ ਵਾਲਟਜ਼ ਐਲਗੋਰਿਥਮ 81 (https://waltz.switchlab.org) ਦੁਆਰਾ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਮੀਲੋਇਡੋਸਿਸ ਦੇ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।NT ਦੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਹੈ, ਅਤੇ β ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ (ਸੋਲਿਡ-ਸਟੇਟ NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ) ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਪੰਜ NT α-helices ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ (H1-H5)28 ਵਜੋਂ ਮਨੋਨੀਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
pH <6.5 'ਤੇ, HT ਘੱਟ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਗਰਮੀ- ਜਾਂ ਯੂਰੀਆ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ 18 ਪ੍ਰਤੀ ਰੋਧਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ NT ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਸਥਿਰਤਾ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦੀ ਹੈ, 100 mg/ml NT ਵਾਲੇ ਹੱਲ pH 8, 7, ਅਤੇ 6 'ਤੇ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਉਲਟ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।NT ਨਮੂਨੇ pH 8 ਅਤੇ 7 ਜੈੱਲ 30 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ 37 ° C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਪਰ pH 8 ਜੈੱਲ ਸਪੱਸ਼ਟ ਰਿਹਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ pH 7 ਜੈੱਲ ਨੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੱਖ ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ (ਚਿੱਤਰ 5a) ਦਿਖਾਇਆ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, pH 6 'ਤੇ HT ਵਾਲਾ ਘੋਲ ਜੈੱਲ ਨਹੀਂ ਬਣਾਉਂਦਾ, ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮੋਨੋਮਰਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਡਾਈਮਰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ।pH 7 ਅਤੇ 6 'ਤੇ NT ਲਈ ਇੱਕ ਪੂਰਵ ਦੇ ਗਠਨ ਦੀ ਉਮੀਦ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਕਿ NT 200 mg/ml27 'ਤੇ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹੈ, ਗਰਮੀ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਮੁੜ-ਫੋਲਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਘੱਟ ਮੁੱਲਾਂ 'ਤੇ α-helix ਨੂੰ ਵੀ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ। pH 18. ਇਹਨਾਂ ਅੰਤਰਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵਿਤ ਵਿਆਖਿਆ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਜਾਂ ਇਸ ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ, ਜਾਂ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 16,18,19 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
NT ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਉਲਟਾ ਟੈਸਟ (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 ਅਤੇ 154 mM NaCl (pH 8) 'ਤੇ 37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ।b NT CD ਸਪੈਕਟਰਾ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 154 mM NaF ਅਤੇ 154 mM NaCl ਦੇ ਨਾਲ ਅਤੇ ਬਿਨਾਂ।222 nm 'ਤੇ ਮੋਲਰ ਅੰਡਾਕਾਰ ਨੂੰ ਕੁਦਰਤੀ ਫੋਲਡ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।c NT ਇਨਵਰਸ਼ਨ ਅਸੇ (100 mg/mL) NT* (37 °C ਅਤੇ 60 °C), NTA72R (37 °C), ਅਤੇ His-NT-L6 (37 °C ਅਤੇ 60 °C)।d NT ਮਿਊਟੈਂਟਸ NT*, NTA72R, ਅਤੇ His-NT-L6 ਦਾ CD ਸਪੈਕਟਰਾ।222 nm 'ਤੇ ਮੋਲਰ ਅੰਡਾਕਾਰ ਨੂੰ ਕੁਦਰਤੀ ਫੋਲਡ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।e NTFlSp, NTMiSp ਅਤੇ ਘਟਾਏ ਗਏ NTMiSp (100 mg/mL) ਦਾ ਉਲਟਾ ਟੈਸਟ।ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 5 ਮਿਲੀਮੀਟਰ.f NT, NTFlSp, NTMiSp ਅਤੇ ਘਟਾਏ ਗਏ NTMiSp ਦਾ CD ਸਪੈਕਟਰਾ।222 nm 'ਤੇ ਮੋਲਰ ਅੰਡਾਕਾਰ ਨੂੰ ਕੁਦਰਤੀ ਫੋਲਡ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।25°C ਅਤੇ 95°C 'ਤੇ ਪੂਰਾ NT ਸਪੈਕਟਰਾ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਸਰੀਰਕ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ NT ਸਬ-ਯੂਨਿਟਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਅਤੇ ਹੇਠਲੇ pH18 ਵਿੱਚ NT ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਦੇ ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ 154 mM NaCl ਅਤੇ NaF ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੇ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ, (Fig. 5a, b; ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2b) ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਲੂਣਾਂ ਨੇ NT ਮੋਨੋਮਰਜ਼ ਦੀ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ (Fig. 5b, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8) .ਇਹ ਇਹ ਵੀ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸਥਿਰਤਾ ਵਧਾਉਣਾ, ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਜੈੱਲ ਬਣਨ ਤੋਂ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।
ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਸਥਿਰਤਾ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਦੀ ਹੋਰ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਦੋ ਮਿਊਟੈਂਟਸ, NT* ਅਤੇ NTA72R ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਘੱਟ pH28.30 'ਤੇ ਵੀ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ।NT* ਇੱਕ ਡਬਲ ਚਾਰਜ ਰਿਵਰਸਲ ਮਿਊਟੈਂਟ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮੋਨੋਮਰ ਦੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਡਿਪੋਲਰ ਚਾਰਜ ਡਿਸਟ੍ਰੀਬਿਊਸ਼ਨ ਨੂੰ ਸਮਤਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮੋਨੋਮਰ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ।NTA72R ਇੱਕ ਚਾਰਜਡ ਡਾਈਪੋਲ ਹੈ, ਪਰ ਆਰਗ-ਸਬਸਟੀਟਿਡ ਅਲਾ ਡਾਈਮਰ ਸੀਮਾ 'ਤੇ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਪਰਿਵਰਤਨ ਡਾਇਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਸਬਯੂਨਿਟ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ 'ਤੇ, NT* ਨੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨਹੀਂ ਬਣਾਇਆ, ਜਦੋਂ ਕਿ NTA72R ਨੇ 15 ਮਿੰਟ (Fig. 5c) ਲਈ ਇੱਕ ਧੁੰਦਲਾ ਜੈੱਲ ਬਣਾਇਆ।ਕਿਉਂਕਿ NT* ਅਤੇ NTA72R ਦੋਵੇਂ ਡਾਈਮਰਾਈਜ਼ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਪਰ ਮੋਨੋਮਰ ਸਥਿਰਤਾ (ਚਿੱਤਰ 5d) ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਹਨ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਉੱਚ ਥਰਮੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਸਥਿਰਤਾ NT ਨੂੰ ਜੈੱਲਿੰਗ ਤੋਂ ਰੋਕਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਇਸ ਤੱਥ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਸਮਰਥਤ ਹੈ ਕਿ HT* ਇੱਕ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਇਹ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਅਸਥਿਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (60°C 'ਤੇ 8 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ; ਚਿੱਤਰ 5c)।ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ NT ਵਿੱਚ ਮੇਥੀਓਨਾਈਨ ਦੀ ਉੱਚ ਸਮੱਗਰੀ ਇਸਦੇ ਕੁਦਰਤੀ ਫੋਲਡਿੰਗ ਨੂੰ ਤਰਲ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਛੇ ਮੇਟ ਟੂ ਲਿਊ ਬਦਲ (ਇੱਥੇ ਹਿਸ-ਐਨਟੀ-ਐਲ6 ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) NT46 ਮੋਨੋਮਰ ਨੂੰ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਨਾਲ ਸਥਿਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਕਿ NT ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਢਾਂਚਾਗਤ ਲਚਕਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ His-NT-L6 ਸਥਿਰ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ 37 °C (ਚਿੱਤਰ 5c, d) 'ਤੇ ਜੈੱਲ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, His-NT-L6 ਨੇ 60 ਮਿੰਟ (ਚਿੱਤਰ 5c) ਲਈ 60°С 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ 'ਤੇ ਇੱਕ ਜੈੱਲ ਵੀ ਬਣਾਈ।
NT ਦੀ β-ਸ਼ੀਟ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਅਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਕੁਝ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੀ ਪ੍ਰਤੀਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਪਰ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦੇ ਸਾਰੇ NT ਡੋਮੇਨਾਂ 'ਤੇ ਨਹੀਂ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੇਸ਼ਮ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਅਤੇ ਮੱਕੜੀ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ NTs, ਟ੍ਰਾਈਕੋਨੇਫਿਲਾ ਕਲੈਵੀਪਜ਼ (NTFlSp), ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਉੱਚ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ (ਚਿੱਤਰ 5e, f ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2) ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਘੱਟ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਅਤੇ ਉੱਚ ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ ਸਮਗਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਅਰੇਨੀਅਸ ਵੈਂਟਰੀਕੋਸਸ (NTMiSp) ਤੋਂ ਛੋਟੇ ਐਂਪੁਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਤੋਂ NT ਨੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ (ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 5e, f) ਨਹੀਂ ਬਣਾਈ।ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ ਨੂੰ ਇੰਟਰਾਮੋਲੀਕੂਲਰ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ 29,47 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਲਗਾਤਾਰ, ਜਦੋਂ NTMiSp ਦੇ ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਘਟਾਏ ਗਏ ਸਨ, ਤਾਂ ਇਹ 10 ਮਿੰਟ (ਚਿੱਤਰ 5e) ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ NT ਤੋਂ ਜੈੱਲ ਦੇ ਗਠਨ ਲਈ ਢਾਂਚਾਗਤ ਲਚਕਤਾ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ, ਪਰ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਮਾਪਦੰਡ ਨਹੀਂ ਹੈ.ਇੱਕ ਹੋਰ ਕਾਰਕ ਜੋ ਪ੍ਰਸੰਗਿਕ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਉਹ ਹੈ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ, ਅਤੇ ਜ਼ਿੱਪਰ ਡੇਟਾਬੇਸ ਅਤੇ ਵਾਲਟਜ਼ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਅਤੇ ਐਮੀਲੋਇਡੋਜਨਿਕ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਸੀਮਾ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਬੰਧ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ। ਸਟੀਰਿਕ ਜ਼ਿੱਪਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ।ਇੱਕ ਸਬੰਧ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 9)।
ਅਨੁਕੂਲ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਫਾਈਬਰਿਲ ਬਣਾਉਣ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ NT ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਅਗਵਾਈ ਕੀਤੀ ਕਿ ਦੂਜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ NT ਫਿਊਜ਼ਨ ਅਜੇ ਵੀ ਫਿਊਜ਼ਨ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੇ ਪੂਰੇ ਕਾਰਜ ਨਾਲ ਜੈੱਲ ਬਣਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਸਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ NT ਦੇ C-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਗ੍ਰੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (GFP) ਅਤੇ purine nucleoside phosphorylase (PNP) ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ E. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਉੱਚ ਅੰਤਮ ਪੈਦਾਵਾਰ (150 mg/L ਅਤੇ 256 mg/L ਸ਼ੇਕ ਫਲਾਸਕ ਕਲਚਰ ਹਿਜ਼-NT-GFP ਅਤੇ His-NT-PNP ਲਈ ਕ੍ਰਮਵਾਰ) ਦੇ ਨਾਲ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ NT ਰੈਫ.30. His-NT-GFP (300mg/mL) ਅਤੇ His-NT-PNP (100mg/mL) ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 2 ਘੰਟੇ ਅਤੇ 6.5 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ 37°C 'ਤੇ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, GFP ਅੰਸ਼ ਕੋਈ ਬਦਲਿਆ ਨਹੀਂ ਰਿਹਾ।ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ, 70% ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬਾਕੀ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 6a)।ਉਸ ਦੇ-NT-PNP ਹੱਲਾਂ ਅਤੇ ਜੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ PNP ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ NT ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕਰਨਾ ਪਿਆ ਕਿਉਂਕਿ ਸ਼ੁੱਧ ਤਿਆਰੀ ਦੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਜੈਲਿੰਗ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਪਰਖ ਦੀ ਖੋਜ ਸੀਮਾ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਸੀ।0.01 mg/mL His-NT-PNP ਅਤੇ 100 mg/mL NT ਵਾਲੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨਾਲ ਬਣੀ ਜੈੱਲ ਨੇ ਪ੍ਰੀ-ਇੰਕਿਊਬੇਟਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ 65% ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ (ਚਿੱਤਰ 6b)।ਮਾਪ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਜੈੱਲ ਬਰਕਰਾਰ ਰਿਹਾ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 10)।
ਹਿਜ਼-ਐਨਟੀ-ਜੀਐਫਪੀ (300 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਐਮਐਲ) ਅਤੇ ਉਲਟੀ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦਿਸਣਯੋਗ ਅਤੇ ਯੂਵੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ His-NT-GFP ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ (300 mg/mL) ਹੈ, ਦੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ।ਪੁਆਇੰਟ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਮਾਪ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ (n = 3), ਗਲਤੀ ਬਾਰ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਔਸਤ ਮੁੱਲ ਗਲਤੀ ਬਾਰ ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।b PNP ਗਤੀਵਿਧੀ NT (100 mg/ml) ਅਤੇ 0.01 mg/ml his-NT-PNP ਅਤੇ 100 mg/ml ਨਿਊ ਤਾਈਵਾਨ ਡਾਲਰ ਵਾਲੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਾਲੇ ਹੱਲਾਂ ਅਤੇ ਜੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਫਲੋਰੋਮੈਟ੍ਰਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਨਸੈੱਟ ਇੱਕ ਉਲਟੀ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ His-NT-PNP (5 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਸਕੇਲ ਬਾਰ) ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ (ਚਿੱਤਰ 1) 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੋਲ ਨੂੰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ NT ਅਤੇ ਹੋਰ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡਰੋਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਦੇ ਗਠਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਜੈਲੇਸ਼ਨ α-ਹੇਲੀਸ ਦੇ β-ਪਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਤੇ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ (ਅੰਜੀਰ 3 ਅਤੇ 4) ਦੇ ਗਠਨ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਇਹ ਖੋਜ ਹੈਰਾਨੀਜਨਕ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ NTs ਕੋਇਲਡ ਗਲੋਬੂਲਰ ਪੰਜ-ਹੇਲਿਕਸ ਬੰਡਲ ਹਨ ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਲਈ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ > 200 mg/mL 4°C 'ਤੇ ਕਈ ਦਿਨਾਂ ਲਈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, NTs µM ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਗਰਮੀ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੁਬਾਰਾ ਬਣ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਫਾਈਬਰਿਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ 10 mg/mL ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਥੋੜ੍ਹਾ ਉੱਚਾ ਤਾਪਮਾਨ (ਚਿੱਤਰ 1) ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਇਸ ਵਿਚਾਰ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲ ਗਲੋਬਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫੋਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਬਣ ਸਕਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸਰੀਰਕ ਸਥਿਤੀਆਂ 48 ਦੇ ਅਧੀਨ ਥਰਮਲ ਉਤਰਾਅ-ਚੜ੍ਹਾਅ ਦੇ ਕਾਰਨ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੁੱਲ੍ਹੇ ਹੋਏ ਰਾਜ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਉਦਾਹਰਨਾਂ ਜੋ ਇਸ ਪਰਿਵਰਤਨ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਇਨਸੁਲਿਨ 49,50, β2-ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੋਬੂਲਿਨ, ਟ੍ਰਾਂਸਥਾਈਰੇਟਿਨ ਅਤੇ ਲਾਈਸੋਜ਼ਾਈਮ 51,52,53।ਹਾਲਾਂਕਿ NT ਇਸਦੇ ਮੂਲ ਰਾਜ ਵਿੱਚ ਇੱਕ α-ਹੇਲਿਕਸ ਹੈ, ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਚੇਨ ਦਾ ਲਗਭਗ 65% ਸਟੀਰਿਕ ਜ਼ਿੱਪਰ ਗਠਨ (ਚਿੱਤਰ 4e) 45 ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਮੋਨੋਮਰ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੋਬਾਈਲ 46 ਹੈ, ਇਹ ਇਹਨਾਂ ਸੰਭਾਵੀ ਐਮੀਲੋਇਡੋਜਨਿਕ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਮੱਧਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚੇ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਬੇਨਕਾਬ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕੁੱਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲ ਗਠਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰਕ ਦੇ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਸਮੇਂ (ਚਿੱਤਰ 1c) ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਸਬੰਧ ਪਾਇਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ NT ਸੰਰਚਨਾ ਨੂੰ ਪਰਿਵਰਤਨ (NT*, His-NT-L6) ਦੁਆਰਾ ਜਾਂ ਲੂਣ ਜੋੜ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਗਠਨ hydrogels (Fig. 5).
ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲ ਇੱਕ ਪੂਰਵ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘੋਲ ਵਿੱਚੋਂ ਅਲੋਪ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਕੁਝ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੈਲਸ 55,56,57 ਬਣਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਫਾਈਬਰਿਲਾਂ ਦਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਪਹਿਲੂ ਅਨੁਪਾਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅਣੂ ਉਲਝਣ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਤਿੰਨ-ਅਯਾਮੀ ਨੈਟਵਰਕ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, 55,58 ਸਾਡੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਬਣਨ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਕਸਰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜਾਂ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੈਵਿਕ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ, ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ (70–90°C) ਅਤੇ/ਜਾਂ ਘੱਟ pH (1.5–3.0) 59,60,61,62 ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਦੁਆਰਾ।ਇੱਥੇ ਵਰਣਿਤ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਨੂੰ ਕਠੋਰ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਾ ਹੀ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਨ ਲਈ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ ਦੁਹਰਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ QDs, ਜੋ ਰੇਸ਼ਮ ਕਤਾਈ ਦੇ ਦੌਰਾਨ β-ਸ਼ੀਟ ਸਵਿਚਿੰਗ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਾਡੀਆਂ ਖੋਜਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਸਮੇਂ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਕਾਫ਼ੀ ਲੰਬੇ ਜਾਂ ਵੱਧ ਸਨ, ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਅਕਸਰ ਅਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 7 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ਤੇਜ਼ ਜੈੱਲ ਸਮਿਆਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, NT ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ>300 mg/mL (30%) ਨੇ ਬਾਕੀ ਸਾਰੇ ਵਰਣਿਤ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਸਪਾਈਡਰ ਸਿਲਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਜੈਲੇਟਿਨ, ਐਲਜੀਨੇਟ (2%), ਅਗਰ (0.5%) ਵਰਗੇ ਕੁਦਰਤੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨੂੰ ਪਛਾੜ ਦਿੱਤਾ। ) ਅਤੇ ਕੋਲੇਜਨ.(0.6%) (ਚਿੱਤਰ 7 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀਆਂ 1 ਅਤੇ 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਦੇ ਜੈੱਲ ਟਾਈਮ ਅਤੇ ਲਚਕੀਲੇ ਮਾਡਿਊਲਸ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਹੋਰ ਸਪਾਈਡ੍ਰੋਇਨ-ਅਧਾਰਿਤ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਅਤੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਕੁਦਰਤੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਵਰਣਨ ਦੇ ਨਾਲ ਹਵਾਲੇ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਹਨ।APS ਅਮੋਨੀਅਮ ਪਰਸਲਫੇਟ, ਕਮਰੇ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ.ਡੇਟਾ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74।
ਜਾਪਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸਪਾਈਡਰੋਨ ਨੇ ਸਟੋਰੇਜ਼ ਦੌਰਾਨ ਗੈਲਿੰਗ ਤੋਂ ਬਚਣ ਦੇ ਤਰੀਕੇ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੇ ਹਨ।ਰੇਸ਼ਮ ਗਲੈਂਡ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਉੱਚ ਤਵੱਜੋ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਵੱਡੇ ਦੁਹਰਾਏ ਖੇਤਰ ਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਸੀਮਾ 'ਤੇ, ਗਲੈਂਡ ਵਿੱਚ NT ਅਤੇ CT ਦੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਗਭਗ 10-20 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ / ਮਿ.ਲੀ. ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਨਿਰੀਖਣ ਕੀਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਗਠਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਲੂਣ ਦੀ ਸਮਾਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 16 ਸਥਿਰ NT, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਰੇਸ਼ਮ ਗ੍ਰੰਥੀਆਂ (ਚਿੱਤਰ 5b) ਵਿੱਚ।ਈ. ਕੋਲੀ ਸਾਇਟੋਸੋਲ ਵਿੱਚ NT ਰੂਪਾਂਤਰ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਜ਼ਿਆਦਾ ਕੱਸਿਆ ਹੋਇਆ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਅੱਗੇ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਲੂਣ ਜਾਂ ਹੋਰ ਕਾਰਕ ਵੀਵੋ ਵਿੱਚ ਇਸਦੇ ਇਕੱਠੇ ਹੋਣ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, NTs ਦੀ β-ਸ਼ੀਟ ਫਾਈਬਰਲਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਫਿਲਾਮੈਂਟ ਦੇ ਗਠਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ NT-amyloid-like fibril ਅਤੇ hydrogel formation ਦੇ ਨਾਵਲ ਪਹਿਲੂਆਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਵੀ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਸ ਵਰਤਾਰੇ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀਕਲ ਅਤੇ ਬਾਇਓਮੈਡੀਕਲ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 8) ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਸੰਕਲਪ ਦੇ ਸਬੂਤ ਵਜੋਂ, ਅਸੀਂ NT ਨੂੰ GFP ਜਾਂ PNP ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਅਤੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ 37 ° C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ GFP ਅਤੇ PNP ਭਿੰਨਾਂ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 6) ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਪਣੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ।ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਸਜ਼ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਐਨਾਲਾਗਸ75 ਦੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਹਨ, ਜੋ ਸਾਡੀ ਖੋਜ ਨੂੰ ਬਾਇਓਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਉਦਯੋਗ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਅਨੁਕੂਲ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਦੀ ਧਾਰਨਾ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਸਥਿਰਤਾ, ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਡਰੱਗ ਰੀਲੀਜ਼ ਅਤੇ ਟਿਸ਼ੂ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਵਰਗੀਆਂ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, NT ਅਤੇ NT* ਕੁਸ਼ਲ ਸਮੀਕਰਨ ਮਾਰਕਰ 30 ਹਨ, ਜਿਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ NT ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ ਉਤਪਾਦਨ ਅਤੇ 3D ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਟਾਰਗੇਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
NT ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (µM) ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ, α-ਹੇਲੀਕਲ ਅਤੇ ਸਥਿਰ ਹੈ।ਉਸੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ, ਪਰ ਵਧਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (> 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਮਿਲੀਲੀਟਰ) 'ਤੇ, NT ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਵਾਲੇ ਜੈੱਲ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।NT ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਫਾਈਬਰਿਲਰ ਜੈੱਲ ਵੀ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ NT ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨੂੰ 3D ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹੇਠਾਂ: NT (PDB: 4FBS) ਅਤੇ ਫਾਈਬਰ ਨੈੱਟਵਰਕਾਂ ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ ਦੇ ਚਿੱਤਰ (ਮੰਨਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਕੇਲ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਖਿੱਚਿਆ ਗਿਆ, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/dbRdJ40)।
ਉਸਾਰੀਆਂ (ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਸਮੇਤ ਪੂਰੀ ਸੂਚੀ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 4 ਦੇਖੋ) ਨੂੰ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ pT7 ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ E. coli BL21 (DE3) ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਲੂਰੀਆ ਬਰੋਥ ਵਿੱਚ ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਈ. ਕੋਲੀ ਨੂੰ ਕੈਨਾਮਾਈਸਿਨ (70 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਲੀ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 30°C ਅਤੇ 250 rpm 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ।ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਫਿਰ 1/100 LB ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕਨਾਮਾਈਸਿਨ ਸੀ ਅਤੇ 30°C ਅਤੇ 110 rpm 'ਤੇ ਕਲਚਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ ਤੱਕ OD600 0.8 ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ।NMR ਅਧਿਐਨਾਂ ਲਈ, ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਨੂੰ M9 ਨਿਊਨਤਮ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਉਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਆਈਸੋਟੋਪਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ 2 g D-ਗਲੂਕੋਜ਼ 13C (Aldrich) ਅਤੇ 1 g ਅਮੋਨੀਅਮ ਕਲੋਰਾਈਡ 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ।ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ 20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੱਕ ਘਟਾਓ ਅਤੇ 0.15 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਆਈਸੋਪ੍ਰੋਪਾਈਲਥੀਓਗਲੈਕਟੋਪੀਰਾਨੋਸਾਈਡ (ਅੰਤਿਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ) ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਦਾ ਕਰੋ।ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕਟਾਈ 7278×g, 20 ਮਿੰਟ ਲਈ 4°C 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ।ਸੈੱਲ ਪੈਲੇਟਾਂ ਨੂੰ 20 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ, ਪੀਐਚ 8 ਵਿੱਚ ਮੁੜ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਅਗਲੀ ਵਰਤੋਂ ਤੱਕ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਿਘਲੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 30 kPa 'ਤੇ ਸੈੱਲ ਡਿਸਪਲੇਟਰ (TS ਸੀਰੀਜ਼ ਮਸ਼ੀਨਾਂ, ਕਾਂਸਟੈਂਟ ਸਿਸਟਮਜ਼ ਲਿਮਿਟੇਡ, ਇੰਗਲੈਂਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਰ 4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਲਾਈਸੈਟਸ ਨੂੰ 25,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।NTMiSp ਲਈ, ਗੋਲੀ ਨੂੰ ਫਿਰ 2 M ਯੂਰੀਆ, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ਅਤੇ 2 ਮਿੰਟ (2 s ਚਾਲੂ/ਬੰਦ, 65%) ਲਈ ਸੋਨਿਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ 25,000 xg, 4° C. ਦੇ ਅੰਦਰ ਦੁਬਾਰਾ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 30 ਮਿੰਟਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਨੀ-ਐਨਟੀਏ ਕਾਲਮ ਉੱਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 20 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ, 2 ਐਮਐਮ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ, ਪੀਐਚ 8 ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 20 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ, 200 ਐਮਐਮ ਇਮੀਡਾਜ਼ੋਲ, ਪੀਐਚ 8 ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। NT2RepCT ਅਤੇ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ NTCT, thrombin ਪਾਚਨ ਉਸ ਅਤੇ NT ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਾਈਟ (ThrCleav) ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਥ੍ਰੋਮਬਿਨ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਸ ਹਿਜ਼-ਐਨਟੀ-ਥ੍ਰਕਲੀਵ-2ਰੇਪ (2Rep ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ), ਹਿਜ਼-ਥਿਓਰੇਡੌਕਸਿਨ-ਥ੍ਰਕਲੀਵ-ਐਨਟੀ (ਐਨਟੀ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ), ਹਿਜ਼-ਥਿਓਰੇਡੌਕਸਿਨ-ਥ੍ਰਕਲੀਵ-ਸੀਟੀ (ਸੀਟੀ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ), ਹਿਜ਼-ਥਿਓਰੇਡੌਕਸਿਨ-ਥ੍ਰਕਲੀਵ-ਐਨਟੀ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ। .* (NT* ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ), ਅਤੇ His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (N ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ)।6-8 kDa ਦੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਪੈਕਟਰਾ/ਪੋਰ ਡਾਇਲਸਿਸ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਕੰਸਟਰੱਕਟਸ ਨੂੰ ਥ੍ਰੋਮਬਿਨ (1:1000) ਨਾਲ ਹਜ਼ਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 20 mm Tris-HCl, pH 8 ਦੇ ਨਾਲ 4° C 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਡਾਇਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਡਾਇਲਸਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਘੋਲ ਨੂੰ ਇੱਕ Ni-NTA ਕਾਲਮ ਉੱਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਆਜ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਲੇ ਗੰਦੇ ਪਾਣੀ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ NTF1Sp ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਜਿਸ ਨੇ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਬ੍ਰੈਡਫੋਰਡ ਪਰਖ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਸੀ, ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵਿਸਥਾਪਨ ਗੁਣਾਂਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 280 nm 'ਤੇ UV ਸਮਾਈ ਨੂੰ ਮਾਪ ਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸ਼ੁੱਧਤਾ SDS ਪੌਲੀਐਕਰੀਲਾਮਾਈਡ (4-20%) ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਅਤੇ ਕੂਮਾਸੀ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਦੇ ਧੱਬੇ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 20 ਮਿੰਟ ਦੇ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ 10 kDa ਅਣੂ ਭਾਰ ਕਟੌਫ ਦੇ ਨਾਲ 4000 xg 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਫਿਲਟਰਾਂ (VivaSpin 20, GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੋਲ ਨੂੰ ਪਿਘਲਾਓ ਅਤੇ ਧਿਆਨ ਨਾਲ 150 μl ਨੂੰ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਸਾਫ਼ ਸੇਪਟਮ ਸ਼ੀਸ਼ੀ (8 x 40 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਵਿੱਚ ਪਾਈਪ ਕਰੋ।ਵਾਸ਼ਪੀਕਰਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਟਿਊਬਾਂ ਨੂੰ ਪੈਰਾਫਿਲਮ ਨਾਲ ਸੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨੇ (n = 3) ਨੂੰ 37°C ਜਾਂ 60°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਮੇਂ-ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦੇਖਣ ਲਈ ਉਲਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਜਿਹੜੇ ਨਮੂਨੇ ਜੈੱਲ ਨਹੀਂ ਸਨ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤੇ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।NTMiSp ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਨੂੰ 10 mM DTT ਪ੍ਰਤੀ 10 µM ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਘਟਾਓ।ਕੁਦਰਤੀ ਮੱਕੜੀ ਦੇ ਰੇਸ਼ਮ ਦੇ ਪਰਤ ਦੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਸਵੀਡਿਸ਼ ਬ੍ਰਿਜ ਸਪਾਈਡਰ ਨੂੰ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਦੋ ਮੁੱਖ ਐਂਪੁਲੇਟਡ ਗ੍ਰੰਥੀਆਂ ਨੂੰ 20 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ ਬਫਰ pH 8 ਦੇ 200 μl ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਰਤ ਨੂੰ ਗ੍ਰੰਥੀਆਂ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।.ਗਲੈਂਡਜ਼ ਦੀਆਂ ਸਮੱਗਰੀਆਂ ਨੂੰ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਸੁੱਕੇ ਭਾਰ ਦੇ ਨਿਰਧਾਰਨ ਲਈ 50 μl (ਸਥਿਰ ਭਾਰ ਤੋਂ 60 ° C 'ਤੇ ਖੁੱਲ੍ਹੀਆਂ ਸ਼ੀਸ਼ੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਦੁਆਰਾ) ਅਤੇ 37 ° C 'ਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਲਈ 150 μl।
ਮਾਪਣ ਵਾਲੀ ਜਿਓਮੈਟਰੀ/ਟੂਲ 20 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਦੇ ਸਿਖਰ ਦੇ ਵਿਆਸ ਅਤੇ 0.5 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਦੇ ਅੰਤਰ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਪਲੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਦਾ ਬਣਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 25 °C ਤੋਂ 45 °C ਤੱਕ ਗਰਮ ਕਰੋ ਅਤੇ 1 °C ਪ੍ਰਤੀ ਮਿੰਟ ਦੀ ਦਰ ਨਾਲ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਪੈਲਟੀਅਰ ਪਲੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 25 °C ਤੱਕ ਵਾਪਸ ਕਰੋ।100 mg/mL ਅਤੇ 300-500 mg/mL ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 0.1 Hz ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਅਤੇ ਸਮੱਗਰੀ ਦੇ ਲੀਨੀਅਰ ਵਿਸਕੋਇਲੇਸਟਿਕ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ 5% ਅਤੇ 0.5% ਦੇ ਦਬਾਅ 'ਤੇ ਵਾਈਬ੍ਰੇਸ਼ਨਲ ਮਾਪ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਵਾਸ਼ਪੀਕਰਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਇੱਕ ਕਸਟਮ ਨਮੀ ਚੈਂਬਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 800 ਤੋਂ 3900 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ-1 ਤੱਕ ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ (IR) ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਲਈ।ਏਟੀਆਰ ਯੰਤਰ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਮਾਰਗ, ਪ੍ਰਯੋਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਦੌਰਾਨ ਸੁੱਕੀ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੀ ਹਵਾ ਨਾਲ ਸਾਫ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਘੋਲ (ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਪਾਣੀ ਦੀ ਸਮਾਈ ਸਿਖਰਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ 500 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/mL) ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਉੱਤੇ ਪਾਈਪ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਜੈੱਲ (500 mg/mL) ਮਾਪ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਫਿਰ ਕ੍ਰਿਸਟਲ (n = 3) ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।1000 ਸਕੈਨ 2 cm-1 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਅਤੇ 2 ਦੇ ਜ਼ੀਰੋ ਡਿਊਟੀ ਚੱਕਰ ਦੇ ਨਾਲ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਦੂਜੇ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਦੀ ਗਣਨਾ OPUS (Bruker) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨੌਂ ਪੁਆਇੰਟਾਂ ਦੀ ਸਮੂਥਿੰਗ ਰੇਂਜ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ 1720 ਅਤੇ 1580 ਸੈ.ਮੀ.-1 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਐੱਫ. ਮੇਂਗੇਜ “ਸਪੈਕਟਰਾਗ੍ਰੀਫ – ਆਪਟੀਕਲ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਸਾਫਟਵੇਅਰ” ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਉਸੇ ਏਕੀਕਰਣ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸਾਧਾਰਨ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ATR-IR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ ਬੀਮ ਦੀ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਡੂੰਘਾਈ ਵੇਵਨੰਬਰ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਉੱਚ ਤਰੰਗ ਸੰਖਿਆਵਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਹੇਠਲੇ ਤਰੰਗ ਸੰਖਿਆਵਾਂ 'ਤੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਮਾਈ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਨ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਅੰਜੀਰ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਪੈਕਟਰਾ ਲਈ ਠੀਕ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।3 ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਬਹੁਤ ਛੋਟੇ ਹਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4)।ਇਸ ਅੰਕੜੇ ਲਈ ਸਹੀ ਸਪੈਕਟਰਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਬਰੂਕਰ ਓਪਸ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਐਮਾਈਡ I ਸਿਖਰ ਦੇ ਅੰਦਰਲੇ ਹਿੱਸਿਆਂ ਦੇ ਭਰੋਸੇਮੰਦ ਡੀਕਨਵੋਲਿਊਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਰੂਪਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਆਪਕ ਮਾਤਰਾ ਸੰਭਵ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਅਭਿਆਸ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ.ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਸ਼ੋਰ ਡੀਕਨਵੋਲਿਊਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ (ਗਲਤ) ਸਿਖਰਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪਾਣੀ ਦੇ ਝੁਕਣ ਕਾਰਨ ਸਿਖਰ ਐਮਾਈਡ I ਸਿਖਰ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪਾਣੀ ਦੀ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ ਸਮਾਨ ਤੀਬਰਤਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਇੱਥੇ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਐਕਿਊਅਸ ਜੈੱਲ।ਇਸਲਈ, ਅਸੀਂ ਐਮਾਈਡ I ਪੀਕ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਾਲ ਕੰਪੋਜ਼ ਕਰਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ ਸਾਡੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਨੂੰ ਸਿਰਫ ਹੋਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੇ ਸਮਰਥਨ ਵਿੱਚ ਵਿਚਾਰਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
50 mg/ml NT ਅਤੇ His-NT2RepCT ਦੇ ਹੱਲ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਜੈੱਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨੂੰ ਫਿਰ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ਨਾਲ 12.5 mg/ml ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਿਲਾ ਕੇ ਜੈੱਲ ਨੂੰ ਤੋੜਨ ਲਈ ਪਾਈਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਅੱਗੇ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜੇਲ ਨੂੰ 20 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ (ਪੀਐਚ 8) ਨਾਲ 10 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਨਮੂਨੇ ਦੇ 5 μl ਨੂੰ ਫਾਰਮਵਰ ਨਾਲ ਲੇਪ ਵਾਲੇ ਤਾਂਬੇ ਦੇ ਗਰਿੱਡ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਵਾਧੂ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਬਲੋਟਿੰਗ ਪੇਪਰ ਨਾਲ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 5 µl MilliQ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 1% ਯੂਰੇਨਿਲ ਫਾਰਮੇਟ ਨਾਲ ਦਾਗਿਆ ਗਿਆ।ਜਜ਼ਬ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕਾਗਜ਼ ਨਾਲ ਵਾਧੂ ਦਾਗ ਹਟਾਓ, ਫਿਰ ਜਾਲ ਨੂੰ ਹਵਾ ਵਿਚ ਸੁਕਾਓ।100 kV 'ਤੇ ਸੰਚਾਲਿਤ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਹਨਾਂ ਗਰਿੱਡਾਂ 'ਤੇ ਇਮੇਜਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਵੇਲੇਟਾ 2k × 2k CCD ਕੈਮਰਾ (ਓਲੰਪਸ ਸਾਫਟ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸੋਲਿਊਸ਼ਨ, GmbH, ਮੁਨਸਟਰ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ x 26,500 ਅਤੇ x 43,000 ਵੱਡਦਰਸ਼ੀ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ (n = 1), 10-15 ਚਿੱਤਰ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ਨੂੰ ਚਿੱਤਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਫਾਈਬਰ ਵਿਆਸ (n = 100, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਫਾਈਬਰਸ) ਦੇ ਮਾਪ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ (ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ) ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਸੀ।ਮੱਧਮਾਨ His-NT2RepCT ਅਤੇ NT ਫਾਈਬਰਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 11.43 (SD 2.035) ਅਤੇ 7.67 (SD 1.389) nm ਸਨ।ਵਿਸ਼ਵਾਸ ਅੰਤਰਾਲ (95%) -4.246 ਤੋਂ -3.275 ਹੈ।ਆਜ਼ਾਦੀ ਦੀਆਂ ਡਿਗਰੀਆਂ = 198, p <0.0001।
10 µM ਥਿਓਫਲੇਵਿਨ T (ThT) ਵਾਲੇ 80 µl ਤਰਲ ਨਮੂਨੇ ਕੋਰਨਿੰਗ 96-ਵੈਲੀ ਬਲੈਕ ਬੋਟਮ ਕਲੀਅਰ ਬੌਟਮ ਪਲੇਟਾਂ (ਕੋਰਨਿੰਗ ਗਲਾਸ 3881, ਯੂਐਸਏ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਥਿਰ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ ਟ੍ਰਿਪਲੀਕੇਟ (n = 3) ਵਿੱਚ ਮਾਪੇ ਗਏ ਸਨ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਅੰਤਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ 440 nm ਉਤਸਾਹ ਫਿਲਟਰ ਅਤੇ ਇੱਕ 480 nm ਨਿਕਾਸੀ ਫਿਲਟਰ (BMG Labtech, Offenburg, Germany ਤੋਂ FLUOStar Galaxy) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ThT ਸਿਗਨਲ ਨਾ ਤਾਂ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਸੀ ਅਤੇ ਨਾ ਹੀ ਬੁਝਿਆ, ਕਿਉਂਕਿ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਬਦਲੇ ਬਿਨਾਂ ThT ਦੀਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਧੁੰਦ ਦੇ ਮਾਪ ਲਈ 360 nm 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਸੋਜ਼ਸ਼।ਬੀਜਣ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, 100 mg/mL ਜੈੱਲ 37° C. 'ਤੇ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ, ਮੁੜ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ 5%, 10%, ਅਤੇ 20% ਦੇ ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਬੀਜਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
His-NT2RepCT ਅਤੇ NT>100 mg/mL ਦੇ ਸਟਾਕਾਂ ਨੂੰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਪਿਘਲਾਓ ਅਤੇ 0.22 µm ਫਿਲਟਰ ਰਾਹੀਂ ਫਿਲਟਰ ਕਰੋ।ਨੈਨੋਡ੍ਰੌਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 280 nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਨੂੰ ਮਾਪ ਕੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇੱਕ ਸਾਫ਼ ਤਲ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ 96-ਖੂਹ ਵਾਲੀ ਕਾਲੀ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਪਲੇਟ (ਕੋਰਨਿੰਗ) ਦੇ ਖੂਹਾਂ ਵਿੱਚ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 20 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ pH 8 ਵਿੱਚ 20 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਵਿੱਚ ਪੇਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 5 μM ThT (ਅੰਤਿਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ), ਕੁੱਲ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। 50 μl ਵਾਲੀਅਮ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਹਰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 37 ° C 'ਤੇ ਇੱਕ CellObserver (Zeiss) ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ 'ਤੇ ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ ਲਾਈਟ ਚੈਨਲ ਅਤੇ FITC ਉਤਸਾਹ ਅਤੇ ThT ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ ਐਮਿਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ ਸੈੱਟਾਂ ਨਾਲ ਚਿੱਤਰਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ 20x/0.4 ਲੈਂਸ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।Zen Blue (Zeiss) ਅਤੇ ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ਚਿੱਤਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਜੈੱਲ ਵੀ NT ਅਤੇ His-NT2RepCT ਹੱਲਾਂ ਤੋਂ 50 mg/mL ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 20 mM Tris pH 8 ਅਤੇ 5 µM ThT ਅਤੇ 90 ਮਿੰਟ ਲਈ 37° C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਜੈੱਲ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਲੈਕ 96 ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਾਫ਼ ਥੱਲੇ ਵਾਲੀ ਪਲੇਟ ਵਿੱਚ 20 mM ਟ੍ਰਿਸ, pH 8, ਅਤੇ 5 μM ThT ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਖੂਹ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।20x/0.4 ਵਿਸਤਾਰ 'ਤੇ ਹਰੇ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਅਤੇ ਚਮਕਦਾਰ ਫੀਲਡ ਚਿੱਤਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰੋ।ਚਿੱਤਰਜੇ ਨੂੰ ਚਿੱਤਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ.
ਹੱਲ NMR ਸਪੈਕਟਰਾ 310 K 'ਤੇ 600 MHz Bruker Avance Neo ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ 'ਤੇ ਇੱਕ QCI Quadrupole Resonance ਪਲਸਡ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਫੀਲਡ ਕ੍ਰਾਇਓਪ੍ਰੋਬ (HFCN) ਨਾਲ ਲੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।13C, 15N ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ 10 mg/mL ਸਮਰੂਪ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਲੇ NMR ਨਮੂਨੇ, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) ਵਿੱਚ ਘੁਲ ਗਏ। .pH 6.7 'ਤੇ NT2RepCT ਦੀਆਂ ਰਸਾਇਣਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 15N-HSQC ਦੇ 2D ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਪੀਕ 23 ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
13C ਦਾ ਮੈਜਿਕ ਐਂਗਲ ਸਪਿਨਿੰਗ ਠੋਸ NMR (MAS) ਸਪੈਕਟਰਾ, 15N-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਲ ਇੱਕ 3.2 mm 13C/15N{1H} ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਰਹਿਤ ਪੜਤਾਲ ਨਾਲ ਲੈਸ 800 MHz 'ਤੇ ਇੱਕ Bruker Avance III HD ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਨਮੂਨਾ ਤਾਪਮਾਨ 277 KHz 'ਤੇ ਇੱਕ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਤਾਪਮਾਨ ਗੈਸ ਸਟ੍ਰੀਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੋ-ਅਯਾਮੀ ਡਾਈਪੋਲ ਰੋਟੇਸ਼ਨਲ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ (DARR) 76 ਅਤੇ ਰੇਡੀਓ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਰੀਕਨੈਕਸ਼ਨ (RFDR) 77 ਸਪੈਕਟਰਾ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 12.5 kHz ਅਤੇ 20 kHz ਦੀ MAS ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।1H ਤੋਂ 13C ਤੱਕ ਕਰਾਸ ਧਰੁਵੀਕਰਨ (CP) 1H 'ਤੇ 60.0 ਤੋਂ 48.0 kHz ਤੱਕ, 13C 'ਤੇ 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS 'ਤੇ) ਅਤੇ ਸੰਪਰਕ ਸਮਾਂ 0.5-1 ms 'ਤੇ ਲੀਨੀਅਰ ਰੈਂਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡਾਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਦੌਰਾਨ ਸਪਾਈਨਲ 6478 ਡੀਕਪਲਿੰਗ 73.5 kHz ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਦਾ ਸਮਾਂ 10 ਮਿਲੀਸਕਿੰਟ ਸੀ ਅਤੇ ਚੱਕਰ ਦੀ ਦੇਰੀ 2.5 ਸਕਿੰਟ ਸੀ।RFDR ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਿੰਗਲ-ਲਿੰਕਡ Cα/Cβ ਸਬੰਧਾਂ ਨੂੰ DARR ਸਪੈਕਟਰਾ ਵਿੱਚ ਗੁਣਾਤਮਕ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਅਤੇ ਗੁਣਾ-ਲਿੰਕਡ ਸਬੰਧਾਂ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
Zipper79 ਡੇਟਾਬੇਸ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ਦੀ ਵਰਤੋਂ NT, NTFlSp, ਅਤੇ NTMiSp ਲਈ ਫਲਟਰ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀਆਂ ਅਤੇ ਰੋਸੇਟਾ ਊਰਜਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਜ਼ਿੱਪਰ ਡੇਟਾਬੇਸ ਰੋਜ਼ੇਟਾ ਐਨਰਜੀ80 ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਮਾਡਲ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਈ ਮੁਫਤ ਊਰਜਾ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।-23 kcal/mol ਜਾਂ ਘੱਟ ਦਾ ਊਰਜਾ ਪੱਧਰ ਫਾਈਬਰਿਲੇਟ ਦੀ ਉੱਚ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਹੇਠਲੀ ਊਰਜਾ ਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਜ਼ਿੱਪਰ ਰੂਪਾਂਤਰ ਵਿੱਚ ਦੋ β-ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਸਥਿਰਤਾ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਵਾਲਟਜ਼ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ NT, NTFlSp ਅਤੇ NTMiSp ਰੈਫ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡੋਜਨਿਕ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।81. (https://waltz.switchlab.org/)।
NT ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੋਲ ਨੂੰ pH 5.5 ਅਤੇ 6.0 'ਤੇ 2-(N-morpholino) ਐਥੇਨੇਸੁਲਫੋਨਿਕ ਐਸਿਡ (MES) ਬਫਰ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਵਾਰ pH 6 ਅਤੇ 7 ਤੱਕ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਅੰਤਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 100 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ / ਮਿ.ਲੀ.
ਮਾਪ ਇੱਕ J-1500 CD ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (JASCO, USA) 'ਤੇ 0.1 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਦੇ ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਗ ਦੇ ਨਾਲ 300 μL ਕਯੂਵੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 20 ਐਮਐਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ (ਪੀਐਚ 8) ਵਿੱਚ 10 μM (n = 1) ਵਿੱਚ ਪੇਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਲੂਣ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ 154 mM NaF ਜਾਂ NaCl ਵਾਲੇ 20 mM ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ (pH 8) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਉਸੇ ਹੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (n = 1) 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਤਾਪਮਾਨ ਸਕੈਨ 25°C ਤੋਂ 95°C ਤੱਕ 1°C/min ਦੀ ਹੀਟਿੰਗ ਦਰ ਨਾਲ 222 nm 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਫੋਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ 260 nm ਤੋਂ 190 nm ਤੱਕ 25 ° C ਤੇ ਅਤੇ 95 ° C ਤੱਕ ਗਰਮ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੰਜ ਸਪੈਕਟਰਾ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪੰਜ ਸਪੈਕਟਰਾ ਔਸਤ, ਸਮੂਥ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਮੋਲਰ ਅੰਡਾਕਾਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਗਏ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਹਿਸ-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ਦੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਸਥਿਤੀਆਂ ਅਧੀਨ ਕਾਲੇ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਤਲ (ਕੋਰਨਿੰਗ ਗਲਾਸ 3881, USA) ਦੇ ਨਾਲ 96-ਵੈਲ ਕੋਰਨਿੰਗ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਤ੍ਰਿਪਤੀ (n = 3) ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ-ਅਧਾਰਿਤ ਪਲੇਟ ਰੀਡਰ ਦੇ ਨਾਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 395 nm ਦੀ ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ ਵੇਵ-ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਨਾਲ ਮਾਪੋ ਅਤੇ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 509 nm ਅਤੇ 2 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਨਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰੋ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਨਾਲ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪੁਰੀਨ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਸ ਐਕਟੀਵਿਟੀ ਅਸੇ ਕਿੱਟ (ਫਲੋਰੋਮੈਟ੍ਰਿਕ ਵਿਧੀ, ਸਿਗਮਾ ਐਲਡਰਚ) ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਵਰਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਜੈੱਲਾਂ ਅਤੇ His-NT-PNP ਵਾਲੇ ਹੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ, His-NT-PNP ਦੇ 10 ng ਨੂੰ 100 mg/mL NT ਨਾਲ 2 μL ਦੀ ਕੁੱਲ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਓ ਕਿਉਂਕਿ ਜੈੱਲ ਨੇ ਸੈੱਟ ਦੇ ਖੋਜ ਅੰਤਰਾਲ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਇੱਕ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਹੈ।ਹਿਜ਼-ਐਨਟੀ-ਪੀਐਨਪੀ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਜੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਹੱਲਾਂ ਲਈ ਨਿਯੰਤਰਣ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਮਾਪ ਦੋ ਵਾਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (n = 2)।ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਦੀ ਫੋਟੋ ਖਿੱਚੀ ਗਈ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਮਾਪ ਦੌਰਾਨ ਜੈੱਲ ਬਰਕਰਾਰ ਰਹੇ।ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 9 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਧਿਐਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਵਧੇਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਲਈ, ਇਸ ਲੇਖ ਨਾਲ ਲਿੰਕ ਕੀਤਾ ਕੁਦਰਤ ਅਧਿਐਨ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇਖੋ।
ਅੰਕੜੇ 1 ਅਤੇ 2 ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਡੇਟਾ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ।1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ਅਤੇ 6, ਪੂਰਕ ਅੰਜੀਰ।3, ਪੂਰਕ ਅੰਜੀਰ।5a, d, ਪੂਰਕ ਅੰਜੀਰ।6 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਅੰਜੀਰ.8. ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਡੇਟਾ ਨੂੰ Zenodo ਡੇਟਾਬੇਸ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ਵਿੱਚ ਹੋਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ NMR ਡੇਟਾ ਨੂੰ BMRBig ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ ਵਿੱਚ ਐਂਟਰੀ ID bmrbig36 ਦੇ ਤਹਿਤ ਪੋਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।GFP ਅਤੇ PNP ਦੇ ਢਾਂਚੇ PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਸਨ।
ਰਾਈਜ਼ਿੰਗ, ਏ. ਅਤੇ ਜੋਹਾਨਸਨ, ਜੇ. ਸਪਿਨਿੰਗ ਆਰਟੀਫੀਸ਼ੀਅਲ ਸਪਾਈਡਰ ਰੇਸ਼ਮ।ਨੈਸ਼ਨਲ ਕੈਮੀਕਲ.ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ.11, 309–315 (2015)।
Babb, PL et al.ਨੇਫਿਲਾ ਕਲੈਵੀਪਸ ਜੀਨੋਮ ਮੱਕੜੀ ਦੇ ਰੇਸ਼ਮ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਨੈਸ਼ਨਲ ਜੈਨੇਟ.49, 895–903 (2017)।