347 12.7*1.24mm ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਿੰਗ, ਸਮਕਾਲੀ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦਾ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਅਤੇ α-synuclein ਅਤੇ tau ਦੇ ਜੋੜ

Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਪ੍ਰਤੀ ਸਲਾਈਡ ਤਿੰਨ ਲੇਖ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਸਲਾਈਡਰ।ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਪਿੱਛੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਹਰ ਇੱਕ ਸਲਾਈਡ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡ ਕੰਟਰੋਲਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।

347 ਸਟੀਲ ਪਾਈਪ ਨਿਰਧਾਰਨ

347 12.7*1.24mm ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਿੰਗ

ਬਾਹਰੀ ਵਿਆਸ: 6.00 mm OD ਤੱਕ 914.4 mm OD, 24" NB ਤੱਕ ਦਾ ਆਕਾਰ ਐਕਸ-ਸਟਾਕ ਉਪਲਬਧ, OD ਆਕਾਰ ਸਟੀਲ ਟਿਊਬਾਂ ਉਪਲਬਧ ਐਕਸ-ਸਟਾਕ

SS 347 ਪਾਈਪ ਮੋਟਾਈ ਰੇਂਜ: 0.3mm - 50mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ਆਦਿ (0.5-12mm) ਜਾਂ ਲੋੜ ਅਨੁਸਾਰ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਗੈਰ-ਨਿਯਮਿਤ ਆਕਾਰ

ਕਿਸਮ: SS 347 ਸਹਿਜ ਪਾਈਪ |SS 347 ERW ਪਾਈਪ |SS 347 ਵੇਲਡ ਪਾਈਪ |SS 347 ਫੈਬਰੀਕੇਟਿਡ ਪਾਈਪ |SS 347 CDW ਟਿਊਬਾਂ, LSAW ਪਾਈਪਾਂ / ਸੀਮ-ਵੇਲਡ / ਮੁੜ ਖਿੱਚੀਆਂ

ਫਾਰਮ: SS 347 ਗੋਲ ਪਾਈਪਾਂ/ ਟਿਊਬਾਂ, SS 347 ਵਰਗ ਪਾਈਪਾਂ/ ਟਿਊਬਾਂ, SS 347 ਆਇਤਾਕਾਰ ਪਾਈਪ/ ਟਿਊਬਾਂ, SS 347 ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਾਂ, SS 347 “U” ਆਕਾਰ, SS 347 ਪੈਨ ਕੇਕ ਕੋਇਲ, SS 347 ਹਾਈਡ੍ਰਾ

ਲੰਬਾਈ: ਸਿੰਗਲ ਰੈਂਡਮ, ਡਬਲ ਬੇਤਰਤੀਬ ਅਤੇ ਲੋੜੀਂਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦਾ ਅੰਤ: ਪਲੇਨ ਐਂਡ, ਬੇਵਲਡ ਐਂਡ, ਟ੍ਰੇਡਡ

ਅੰਤ ਦੀ ਸੁਰੱਖਿਆ: ਪਲਾਸਟਿਕ ਕੈਪਸ |ਬਾਹਰੀ ਫਿਨਿਸ਼: 2B, No.4, No.1, No.8 ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਪਾਈਪਾਂ ਲਈ ਮਿਰਰ ਫਿਨਿਸ਼, ਗਾਹਕ ਦੀਆਂ ਲੋੜਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਮੁਕੰਮਲ

ਡਿਲਿਵਰੀ ਦੀ ਸਥਿਤੀ: ਐਨੀਲਡ ਅਤੇ ਅਚਾਰ, ਪਾਲਿਸ਼ਡ, ਬ੍ਰਾਈਟ ਐਨੀਲਡ, ਕੋਲਡ ਡਰੋਨ

ਨਿਰੀਖਣ, ਟੈਸਟ ਰਿਪੋਰਟਾਂ: ਮਿੱਲ ਟੈਸਟ ਸਰਟੀਫਿਕੇਟ, EN 10204 3.1, ਰਸਾਇਣਕ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, ਮਕੈਨੀਕਲ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, PMI ਟੈਸਟ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਇੰਸਪੈਕਸ਼ਨ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, ਥਰਡ ਪਾਰਟੀ ਇੰਸਪੈਕਸ਼ਨ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, NABL ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਲੈਬ ਰਿਪੋਰਟਾਂ, ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਟੈਸਟ ਰਿਪੋਰਟ, ਗੈਰ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਟੈਸਟ ਰਿਪੋਰਟਾਂ

ਪੈਕਿੰਗ: ਲੱਕੜ ਦੇ ਬਕਸੇ, ਪਲਾਸਟਿਕ ਬੈਗ, ਸਟੀਲ ਦੀਆਂ ਪੱਟੀਆਂ ਬੰਡਲ ਵਿੱਚ ਪੈਕ, ਜਾਂ ਗਾਹਕਾਂ ਦੀਆਂ ਬੇਨਤੀਆਂ ਅਨੁਸਾਰ

ਵਿਸ਼ੇਸ਼: ਉਪਰੋਕਤ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਨਿਰਧਾਰਨ ਬੇਨਤੀ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ

SS 347 ਪਾਈਪ ਆਕਾਰ ਰੇਂਜ: 1/2 ਇੰਚ NB, OD ਤੋਂ 24 ਇੰਚ

ASTM A312 347: ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਆਮ ਖੋਰ ਸੇਵਾ ਲਈ ਨਿਰਵਿਘਨ ਅਤੇ ਸਿੱਧੀ-ਸੀਮ ਵੇਲਡਡ ਔਸਟੇਨੀਟਿਕ ਪਾਈਪ।ਵੈਲਡਿੰਗ ਦੌਰਾਨ ਫਿਲਰ ਮੈਟਲ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਨਹੀਂ ਹੈ।

ASTM A358 347: ਖਰਾਬ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਸੇਵਾ ਲਈ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਫਿਊਜ਼ਨ ਵੇਲਡ ਔਸਟੇਨੀਟਿਕ ਪਾਈਪ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਸ ਨਿਰਧਾਰਨ ਲਈ ਸਿਰਫ 8 ਇੰਚ ਤੱਕ ਪਾਈਪ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਵੈਲਡਿੰਗ ਦੌਰਾਨ ਫਿਲਰ ਮੈਟਲ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਹੈ।

ASTM A790 347: ਸਹਿਜ ਅਤੇ ਸਿੱਧੀ-ਸੀਮ ਵੇਲਡ ਫੈਰੀਟਿਕ/ਔਸਟੇਨੀਟਿਕ (ਡੁਪਲੈਕਸ) ਪਾਈਪ ਜੋ ਕਿ ਤਣਾਅ ਖੋਰ ਕ੍ਰੈਕਿੰਗ ਦੇ ਵਿਰੋਧ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਜ਼ੋਰ ਦੇ ਨਾਲ, ਆਮ ਖੋਰ ਸੇਵਾ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।

ASTM A409 347: ਸਟ੍ਰੇਟ-ਸੀਮ ਜਾਂ ਸਪਿਰਲ-ਸੀਮ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਫਿਊਜ਼ਨ 14” ਤੋਂ 30” ਆਕਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ ਔਸਟੇਨੀਟਿਕ ਲਾਈਟ-ਵਾਲ ਪਾਈਪ ਨੂੰ ਖੋਰ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਉੱਚੀਆਂ ਲਈ ਕੰਧਾਂ Sch5S ਅਤੇ Sch 10S ਦੇ ਨਾਲ

ASTM A376 347: ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀਆਂ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਸਹਿਜ ਅਸਟੇਨੀਟਿਕ ਪਾਈਪ।

ASTM A813 347: ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਆਮ ਖੋਰ ਵਾਲੀਆਂ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਸਿੰਗਲ-ਸੀਮ, ਸਿੰਗਲ- ਜਾਂ ਡਬਲ-ਵੇਲਡਡ ਅਸਟੇਨੀਟਿਕ ਪਾਈਪ।

ASTM A814 347: ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਆਮ ਖਰਾਬ ਸੇਵਾ ਲਈ ਕੋਲਡ-ਵਰਕਡ ਵੈਲਡਡ ਅਸਟੇਨੀਟਿਕ ਪਾਈਪ।

347H ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ ਪਾਈਪ ਰਸਾਇਣਕ ਰਚਨਾ

ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ 347H ਪਾਈਪ ਮਕੈਨੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ

ਸਟੀਲ 347H ਪਾਈਪ ਭੌਤਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ

347H ਸਟੇਨਲੈੱਸ ਸਟੀਲ ਪਾਈਪ ਲਈ ਬਰਾਬਰ ਗ੍ਰੇਡ

ਐਮੀਲੋਇਡ ਅਲਫ਼ਾ-ਸਾਈਨੁਕਲੀਨ (αS) ਏਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਪਾਰਕਿੰਸਨ'ਸ ਦੀ ਬਿਮਾਰੀ ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਿਨੂਕਲੀਨੋਪੈਥੀਜ਼ ਦੀ ਪਛਾਣ ਹੈ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਲਜ਼ਾਈਮਰ ਰੋਗ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਟਾਊ ਪ੍ਰੋਟੀਨ αS ਪੈਥੋਲੋਜੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਅਤੇ αS-ਅਮੀਰ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸਹਿ-ਸਥਾਨਕ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇਕੱਠੇ ਹੋਣ ਦੀ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਅਸਪਸ਼ਟ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇੱਥੇ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ αS ਪੜਾਅ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡਸ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟਾਊ ਦੇ ਨਾਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦੁਆਰਾ ਤਰਲ ਸੰਘਣਤਾ ਵਿੱਚ ਵੱਖ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ αS ਦੀ ਸਾਂਝ ਅਤੇ ਕੋਗੂਲੇਸ਼ਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੀ ਵੈਲੈਂਸ ਘਟਣ ਦੀ ਦਰ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਗਤਲੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਜਾਂ ਇਕਸਾਰਤਾ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਹਨ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੌਲੀ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਅਡਵਾਂਸਡ ਬਾਇਓਫਿਜ਼ੀਕਲ ਤਕਨੀਕਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਸੂਟ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ, ਅਸੀਂ ਤਰਲ-ਤਰਲ αS/Tau ਪੜਾਅ ਦੇ ਵਿਭਾਜਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਮੁੱਖ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੋ ਗਏ ਜੋ ਤਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣੇਪਣ ਵਿੱਚ ਦੋਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਵਿਭਿੰਨ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੇ ਹਨ।
ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਥਾਨਿਕ ਵਿਭਾਜਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਅਮੀਰ, ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਸੰਘਣੇ ਸਰੀਰਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਬਾਇਓਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਸੰਘਣੇ ਜਾਂ ਬੂੰਦਾਂ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਰਲ-ਤਰਲ ਪੜਾਅ ਵਿਭਾਜਨ (LLPS) ਵਜੋਂ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ ਇੱਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ।ਇਹ ਬੂੰਦਾਂ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ ਟੈਂਪੋਰਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਈਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਵਿਚਕਾਰ, ਅਤੇ ਲਗਭਗ ਸਾਰੇ ਜੀਵਿਤ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਸੇਵਾ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਐਲਐਲਪੀ-ਸਮਰੱਥ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੱਟ ਜਟਿਲਤਾ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਕੁਦਰਤ ਵਿੱਚ ਅਤੇ ਬਾਇਓਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਕੰਡੈਂਸੇਟਸ 3,4,5 ਦੇ ਗਠਨ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਵਿਗਾੜ ਹਨ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਲਚਕਦਾਰ, ਅਕਸਰ ਵਿਗਾੜ ਵਾਲੀ, ਅਤੇ ਬਹੁਪੱਖੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਸੰਘਣੇਪਣ ਨੂੰ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਖਾਸ ਅਣੂ ਨਿਰਧਾਰਕਾਂ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਸੰਘਣੀਆਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਠੋਸ-ਵਰਗੇ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਰਾਜ।.
ਨਵਾਂ ਡੇਟਾ ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਸੰਚਾਲਿਤ LLPS ਅਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਠੋਸ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਸੰਬੰਧਤ ਸੈਲੂਲਰ ਮਾਰਗ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਜੋ ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਜ਼ਹਿਰੀਲੇ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ਅਕਸਰ ਡੀਜਨਰੇਟਿਵ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਲੱਛਣ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ LLPS-ਸਬੰਧਿਤ ਅੰਦਰੂਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਗਾੜਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (IDPs), ਅਕਸਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਲਚਕਦਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, FUS7 ਜਾਂ TDP-438 ਵਰਗੇ ਬਾਇਓਮੋਲੀਕਿਊਲਰ IDP ਸੰਘਣੇ ਜਾਂ ਵੱਡੇ ਘੱਟ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਡੋਮੇਨਾਂ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ hnRNPA19 ਨੂੰ ਤਰਲੀਕਰਨ ਨਾਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਜੈੱਲ-ਵਰਗੇ ਜਾਂ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਠੋਸ ਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚ ਉਮਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਮਿਸ਼ਰਣਸਮੇਂ ਦੇ ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਜੋਂ ਜਾਂ ਕੁਝ ਪੋਸਟ-ਅਨੁਵਾਦਕ ਸੋਧਾਂ ਜਾਂ ਪੈਥੋਲੋਜੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਪਰਿਵਰਤਨ 1,7 ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਠੋਸ ਪੜਾਅ ਤਬਦੀਲੀ (LSPT) ਵਿੱਚ.
ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ LLPS ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਇੱਕ ਹੋਰ IDP Tau ਹੈ, ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਿਊਬਿਊਲ-ਸਬੰਧਿਤ ਵਿਗਾੜ ਵਾਲਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਿਸਦਾ ਐਮੀਲੋਇਡ ਏਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਅਲਜ਼ਾਈਮਰ ਰੋਗ 10 ਵਿੱਚ ਫਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਪਰ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਪਾਰਕਿੰਸਨ'ਸ ਰੋਗ (PD) ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨੋਪੈਥੀ 11, 12, 13 ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹਨ।ਤਾਊ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਘੋਲ/ਸਾਈਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਤੋਂ ਸਵੈਚਲਿਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਿਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਟਾਊ-ਅਨੁਕੂਲ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵੀ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੀ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆ ਕੁਦਰਤ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਬਾਇਓਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਸੰਘਣੇਪਣ ਦੇ ਪਿੱਛੇ ਡ੍ਰਾਈਵਿੰਗ ਬਲ ਹੈ15।ਇੱਕ ਟਾਊ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਸਧਾਰਨ ਏਕੀਕਰਣ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਈ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਉਲਟ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਕਲੀਵੇਜ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਾਂ ਆਰਐਨਏ ਵਰਗੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਪੋਲੀਮਰਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਏਕੀਕਰਣ ਦੁਆਰਾ।
ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, α-synuclein (αS), ਇੱਕ ਐਮੀਲੋਇਡ IDP ਜੋ PD ਅਤੇ ਹੋਰ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਟਿਵ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ synucleinopathy17,18 ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ ਸੈਲੂਲਰ ਅਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ 19,20 ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਵਿਵਹਾਰ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣੇ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ।ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ αS ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸਧਾਰਨ ਏਕੀਕਰਣ ਦੁਆਰਾ LLPS ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦਾ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲੰਬੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਸਮੇਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ 19,21।ਕੀ ਵੀਵੋ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ αS- ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਸੰਘਣੇਪਣ ਇਸ ਜਾਂ ਹੋਰ LLPS ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਹਨ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਅਣਸੁਲਝਿਆ ਮੁੱਦਾ ਬਣਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਹਾਲਾਂਕਿ αS ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ PD ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਿਨੂਕਲੀਨੋਪੈਥੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਸਹੀ ਵਿਧੀ ਜਿਸ ਦੁਆਰਾ αS ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦਾ ਹੈ, ਅਸਪਸ਼ਟ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸਨ ਆਪਣੇ ਆਪ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਵਾਧੂ ਸੈਲੂਲਰ ਨੁਕਸਾਨ ਦੀ ਅਕਸਰ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ αS ਐਮੀਲੋਇਡ ਅਸੈਂਬਲੀਆਂ ਦੇ ਪੁਨਰ-ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਕੁਝ ਸੈਲੂਲਰ ਸਥਾਨਾਂ ਜਾਂ ਮਾਈਕ੍ਰੋਐਨਵਾਇਰਨਮੈਂਟਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਸੈਲੂਲਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਜੋ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਕੱਠੇ ਹੋਣ ਦਾ ਖ਼ਤਰਾ ਹੈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣੇ 23 ਦਾ ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਿੱਸਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, αS ਅਤੇ tau ਨੂੰ ਪਾਰਕਿੰਸਨ'ਸ ਦੀ ਬਿਮਾਰੀ ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਿਨੂਕਲੀਨੋਪੈਥੀਜ਼ 24,25 ਵਾਲੇ ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ ਲੱਛਣਾਂ ਦੇ ਰੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਹਿ-ਸਥਾਨਕ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੇ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 26,27 ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਰੋਗ ਸੰਬੰਧੀ ਸਬੰਧ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਹੈ ਜੋ ਕਿ ਏਕੀਕਰਣ αS ਅਤੇ neurodegenerative ਰੋਗ ਵਿੱਚ tau.ਬਿਮਾਰੀ.αS ਅਤੇ tau ਨੂੰ ਵਿਟਰੋ ਅਤੇ ਵੀਵੋ 28,29 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਦੇ ਏਕੀਕਰਣ ਨੂੰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਣ ਅਤੇ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਬਣੇ ਵਿਪਰੀਤ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ ਸਿੰਨਿਊਕਲੀਨੋਪੈਥੀ 30 ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, αS ਅਤੇ tau ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਅਣੂ ਆਧਾਰ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਸਹਿ-ਇਕੱਠੇਕਰਨ ਦੀ ਵਿਧੀ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।αS ਨੂੰ αS ਦੇ ਬਹੁਤ ਹੀ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਅਤੇ ਤਾਊ ਦੇ ਕੇਂਦਰੀ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ-ਅਮੀਰ ਖੇਤਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਖਿੱਚ ਦੁਆਰਾ ਤਾਊ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਜੋ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਭਰਪੂਰ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ αS ਸੱਚਮੁੱਚ ਟਾਊ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦੁਆਰਾ ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਦੇ ਦੂਜੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡਸ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੌਲੀ-ਐਲ-ਲਾਈਸਿਨ (ਪੀਐਲਕੇ) ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਉਲਟ, ਅਤੇ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ।αS ਡਰਾਪਲੇਟ ਨੈਟਵਰਕ ਲਈ ਇੱਕ ਸਕੈਫੋਲਡ ਅਣੂ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ αS ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਅੰਤਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਕੋਸਰਵੇਟ ਨੈਟਵਰਕ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਵੈਲੈਂਸੀ ਅਤੇ ਤਾਕਤ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਅਸੀਂ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਰਹਿਣ ਵਾਲੇ ਤਰਲ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ αS ਅਤੇ tau amyloid ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸਹਿ-ਇਕਤਰੀਕਰਨ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਅਤੇ ਕੁਝ ਮੁੱਖ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜੋ ਅਜਿਹੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਸਹਿ-ਇਕਤਰੀਕਰਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੇ ਹਨ।ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਵਿਸਤਾਰ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ ਕਿ ਬਿਮਾਰੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸੰਮਿਲਨਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਸਮੂਹੀਕਰਨ ਦੇ ਅਧੀਨ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਹੈ।
αS ਕੋਲ ਨਿਰਪੱਖ pH (Fig. 1a) 'ਤੇ ਇੱਕ ਉੱਚ ਐਨੀਓਨਿਕ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਪੂਛ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਿਕ ਵਿਗਾੜ ਵਾਲੇ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਸੰਘਣੇਕਰਨ ਦੁਆਰਾ LLPS ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਨਿਊਟਰਲ pH 32 'ਤੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਤੇ ਵਿਗਾੜਿਤ ਪੌਲੀਮੇਰਿਕ ਸੁਭਾਅ ਦੇ ਕਾਰਨ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਮਾਡਲ ਅਣੂ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ 100-ਰੈਜ਼ੀਡਿਊ ਪੌਲੀ-ਐਲ-ਲਾਈਸਿਨ (pLK) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ pLK ਹੱਲ NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ αS ਦੇ Ct ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ। (ਚਿੱਤਰ 1b) αS:pLK ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ ਵਧਣ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 13C/15N-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ αS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।αS ਦੇ Ct-ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਨਾਲ pLK ਦਾ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਆਪਣੇ ਆਪ ਨੂੰ ਰਸਾਇਣਕ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਗੜਬੜ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇਸ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸਿਖਰ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਲਗਭਗ αS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ αS ਨੂੰ pLK ਨਾਲ ਮਿਲਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।ਪੋਲੀਥੀਨ ਗਲਾਈਕੋਲ (5–15% PEG-8) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 5–25 µM (ਆਮ LLPS ਬਫਰ: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ਅਸੀਂ ਤੁਰੰਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਾਉਣ ਦੇ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘੇ। .ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ (WF) ਅਤੇ ਬ੍ਰਾਈਟ-ਫੀਲਡ (BF) ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (Fig. 1c) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬੂੰਦਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।1-5 µm ਬੂੰਦਾਂ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦਰਿਤ αS (ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ 1 µM AlexaFluor488-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ αS, AF488-αS), ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ 10% 1,6-ਹੈਕਸਨੇਡੀਓਲ (1,6-HD) ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਤੋਂ ਲਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। NaCl ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ (ਚਿੱਤਰ 1c)।αS/pLK ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੀ ਤਰਲ-ਵਰਗੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਨੂੰ ਮਿਲੀਸਕਿੰਟ (ਚਿੱਤਰ 1d) ਦੇ ਅੰਦਰ ਫਿਊਜ਼ ਕਰਨ ਦੀ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।turbidimetry ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ, ਇਸਦੀ ਸਥਿਰਤਾ (Fig. 1e) ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮੁੱਖ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ LLPS ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ (Fig. 1f) 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਮਰ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਪੋਲੀਮਰ ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਦੇਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ pLK αS ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਬਹੁਤ ਅਨੁਕੂਲ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਐਲਐਲਪੀ ਨੂੰ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਡਿਸਪਲੇਸਿੰਗ ਏਜੰਟ dextran-70 (70 kDa) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜਾਂ ਗਲਾਸ ਸਲਾਈਡ ਡਰਾਪਾਂ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੱਗਰੀਆਂ ਦੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਖੂਹ, ਐਪੇਨਡੋਰਫ ਜਾਂ ਕੁਆਰਟਜ਼ ਕੇਸ਼ੀਲਾਂ ਸਮੇਤ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਫਾਰਮੈਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ WT-αS ਅਤੇ ΔCt-αS ਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ।ਐਮਫੀਪੈਥਿਕ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਫਾਰਮਿੰਗ (ਐਨਏਸੀ) ਖੇਤਰ, ਅਤੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਨੀਲੇ, ਸੰਤਰੀ ਅਤੇ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।WT-αS ਦਾ ਸ਼ੁੱਧ ਚਾਰਜ ਪ੍ਰਤੀ ਰਹਿਤ (NCPR) ਨਕਸ਼ਾ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।b macromolecular clumps ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ αS/pLK ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ NMR ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ pLK ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਧਦਾ ਹੈ (αS:pLK ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ 1:0.5, 1:1.5, ਅਤੇ 1:10 ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਹਲਕੇ ਹਰੇ, ਹਰੇ ਅਤੇ ਗੂੜ੍ਹੇ ਹਰੇ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ)।c Coacervate αS/pLK (ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ 1:10) 25 µM (1 µM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ αS ਜਾਂ WF ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ pLK) LLPS ਬਫਰ (ਟੌਪ) ਵਿੱਚ ਜਾਂ 500 mMtobot NaCl ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਜਾਂ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ (ਖੱਬੇ ਪਾਸੇ) % 1,6-ਹੈਕਸਨੇਡੀਓਲ (1,6-ਐਚਡੀ; ਹੇਠਾਂ ਸੱਜੇ)।ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 20 µm।d 25 μM ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ αS/pLK (ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ 1:10) ਦੇ BF ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਮਾਈਕਰੋਸਕੋਪਿਕ ਚਿੱਤਰ;ਤੀਰ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਤੁਪਕੇ (ਲਾਲ ਅਤੇ ਪੀਲੇ ਤੀਰ) ਨੂੰ 200 ms ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਬੂੰਦ (ਸੰਤਰੀ ਤੀਰ) ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਉਣ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਦਿੰਦੇ ਹਨ)।ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 20 µm।e ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ (350 nm 'ਤੇ) 25 µM αS 'ਤੇ 500 mM NaCl ਜਾਂ 10% 1,6-HD ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ αS/pLK ਇਕੱਤਰੀਕਰਨ (N = 3 ਨਮੂਨਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ, ਮੱਧਮਾਨ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਵੀ ਦਰਸਾਏ ਗਏ)।f BF ਚਿੱਤਰ (ਟੌਪ) ਅਤੇ 25 μM αS 'ਤੇ αS/pLK ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਦਾ ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (350 nm, ਹੇਠਾਂ) αS:pLK ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ (N = 3 ਨਮੂਨਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ, ਮੱਧਮਾਨ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਵੀ ਦਰਸਾਏ ਗਏ) ਦੇ ਨਾਲ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 10 µm।ਇੱਕ ਚਿੱਤਰ ਉੱਤੇ ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ ਇੱਕ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ ਸਾਰੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਦੇ ਪੈਮਾਨੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
αS/pLK ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦੇ ਸਾਡੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਅਤੇ tau31 ਦੇ ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਦੁਆਰਾ tau/RNA ਸੰਘਣੇਪਣ ਦੇ ਇੱਕ ਕਲਾਇੰਟ ਅਣੂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ αS ਦੇ ਪਿਛਲੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਕਿ αS ਅਤੇ tau RNA ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਨਾਲ ਸਹਿ-ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਸੰਘਣਾਕਰਨ.ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਰਾਹੀਂ, ਅਤੇ αS αS/Tau coacervates ਵਿੱਚ ਸਕੈਫੋਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2e ਵਿੱਚ ਟਾਊ ਚਾਰਜ ਡਿਸਟ੍ਰੀਬਿਊਸ਼ਨ ਦੇਖੋ)।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਜਦੋਂ 10 μM αS ਅਤੇ 10 μM Tau441 (ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1 μM AF488-αS ਅਤੇ 1 μM Atto647N-Tau ਰੱਖਦਾ ਹੈ) ਨੂੰ LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕਠੇ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ ਉਹਨਾਂ ਨੇ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੂਹਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।(ਚਿੱਤਰ 2a).ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸਮੂਹਿਕਕਰਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਨਫੋਕਲ (ਸੀਐਫ) ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1a) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦਾ ਵਿਵਹਾਰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ dextran-70 ਨੂੰ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਏਜੰਟ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1c) ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਜਾਂ ਤਾਂ FITC-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ PEG ਜਾਂ dextran ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਦੋਵੇਂ ਭੀੜ-ਭੜੱਕੇ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟਾਂ ਨੂੰ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਨਾ ਤਾਂ ਵੱਖਰਾ ਹੋਣਾ ਅਤੇ ਨਾ ਹੀ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1d) ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ।ਇਸ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਉਹ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕੂਲਰ ਭੀੜ-ਭੜੱਕੇ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ PEG ਇੱਕ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਥਿਰ ਭੀੜ-ਭੜੱਕਾ ਏਜੰਟ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੋਰ LLP ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ 33,34 ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਭਰਪੂਰ ਬੂੰਦਾਂ NaCl (1 M) ਲਈ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਸਨ ਪਰ 1,6-HD (10% v/v) ਲਈ ਨਹੀਂ, ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2a, b)।BF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (Fig. 2b) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮਿਲੀਸਕਿੰਟ ਅਭੇਦ ਹੋਣ ਵਾਲੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਦੀਆਂ ਘਟਨਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖ ਕੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਤਰਲ ਵਿਵਹਾਰ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ αS/Tau441 ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੇ ਇੱਕ ਕਨਫੋਕਲ (CF) ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਚਿੱਤਰ (ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ 10 μM, AF488-ਲੇਬਲ αS ਦਾ 0.5 μM ਅਤੇ Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ Tau441)।b αS/Tau441 ਡਰਾਪਲੇਟ ਫਿਊਜ਼ਨ ਇਵੈਂਟਸ (ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ 10 μM) ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਵਿਭਿੰਨ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਕੰਟ੍ਰਾਸਟ (DIC) ਚਿੱਤਰ।c 50 µM αS ਦੀ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਮੌਜੂਦਗੀ (ਸੱਜੇ) ਵਿੱਚ Tau441 LLPS (0–15 µM) ਦੇ ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ (350 nm 'ਤੇ) 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਪੜਾਅ ਚਿੱਤਰ।ਗਰਮ ਰੰਗ ਵਧੇਰੇ ਖਿੰਡੇ ਜਾਣ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।d ਵਧਦੀ αS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ αS/Tau441 LLPS ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਹਲਕਾ ਖਿਲਾਰਾ (5 µM 'ਤੇ Tau441, N = 2–3 ਨਮੂਨਾ ਦੁਹਰਾਓ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਹਨ)।e ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਕੁਝ ਟਾਊ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰੂਪਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ: ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ (ਲਾਲ), ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ-ਅਮੀਰ ਖੇਤਰ (ਨੀਲਾ), ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਿਊਬਿਊਲ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ (ਐਮਟੀਬੀਡੀ, ਸੰਤਰੀ ਵਿੱਚ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ), ਅਤੇ amyloid-ਸਰੂਪ ਜੋੜਾ ਚੂੜੀਦਾਰ.MTBD (ਗ੍ਰੇ) ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਥਿਤ ਫਿਲਾਮੈਂਟ ਖੇਤਰ (PHF)।Tau441 ਦਾ ਸ਼ੁੱਧ ਚਾਰਜ ਪ੍ਰਤੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (NCPR) ਨਕਸ਼ਾ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।f 1 µM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ αS ਅਤੇ Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ΔNt- ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ΔNt-Tau (ਉੱਪਰ, 10 µM ਪ੍ਰਤੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਜਾਂ K18 (ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਤੀ ਬੋਟੋ, 10 µM ਪ੍ਰਤੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 1 µM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ αS ਜਾਂ ΔCt-αS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ। ) ) ) LLPS ਜਾਂ K18 ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਸੰਘਣੇ WF ਦੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ।ਇੱਕ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਸਕੇਲ ਬਾਰ ਇੱਕ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਚਿੱਤਰਾਂ ਦੇ ਪੈਮਾਨੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ (ਪੈਨਲ a, b ਅਤੇ f ਲਈ 20 µm)।ਪੈਨਲਾਂ c ਅਤੇ d ਲਈ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਇਸ LLPS ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ αS ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ NaCl (Fig. 2c) ਦੀ ਵਧਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨੇਫੇਲੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਬੂੰਦਾਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ 'ਤੇ αS ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।αS ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਲੂਣ ਦੀ ਤਵੱਜੋ ਜਿੰਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ ਵੈਲਯੂਜ਼ (350 nm 'ਤੇ) ਉੱਚੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਇਸ LLPS ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ αS ਦੀ ਸਥਿਰ ਭੂਮਿਕਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਪ੍ਰਭਾਵ αS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ αS:Tau441 ਅਨੁਪਾਤ) ਨੂੰ ਲਗਭਗ ਵਧਾ ਕੇ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਤਾਊ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (5 µM) (ਚਿੱਤਰ 2d) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ 10 ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ।ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਕਿ αS ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਕੈਫੋਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ, ਅਸੀਂ LLPS-ਵਿਘਨ ਪਾਉਣ ਵਾਲੇ ਟਾਊ ਮਿਊਟੈਂਟ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ (ਅਵਸ਼ੇਸ਼ 1-150, ਚਿੱਤਰ 2e ਦੇਖੋ) ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ ਜਿਸਨੂੰ ΔNt-Tau ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਅਤੇ ਨੈਫੇਲੋਮੈਟਰੀ ਨੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ ΔNt-Tau ਖੁਦ LLPS (Fig. 2f ਅਤੇ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ Fig. 2d) ਤੋਂ ਨਹੀਂ ਗੁਜ਼ਰਿਆ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਸੀ 14. ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜਦੋਂ αS ਨੂੰ ਇਸ ਕੱਟੇ ਹੋਏ Tau ਵੇਰੀਐਂਟ ਦੇ ਡਿਸਪਲੇਸ਼ਨ ਹੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ LLPS ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੀ. ਸਮਾਨ ਸਥਿਤੀਆਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਧੀਨ Tau ਅਤੇ αS ਦੇ ਪੂਰੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਹੱਲਾਂ ਦੀ ਬੂੰਦ ਘਣਤਾ ਦੇ ਨੇੜੇ ਬੂੰਦ ਘਣਤਾ ਨਾਲ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਘੱਟ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕੂਲਰ ਭੀੜ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2c) ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ αS ਖੇਤਰ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ, ਪਰ ਇਸਦੀ ਪੂਰੀ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਨਹੀਂ, LLPS ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ ਕੱਟੇ ਹੋਏ αS ਵੇਰੀਐਂਟ (ΔCt-) ਦੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 104-140 (ਚਿੱਤਰ 1a) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। αS) ਪ੍ਰੋਟੀਨ (Fig. 2f ਅਤੇ ਪੂਰਕ Fig. 2d)।αS ਅਤੇ ΔNt-Tau ਦੇ ਸਮੂਹਿਕਕਰਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਨਫੋਕਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1b) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
Tau441 ਅਤੇ αS ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ LLPS ਵਿਧੀ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਇੱਕ ਵਾਧੂ Tau ਰੂਪ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਰਥਾਤ ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਿਊਬਿਊਲ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ (MTBD) ਵਿੱਚ ਪੇਅਰਡ ਹੈਲੀਕਲ ਫਿਲਾਮੈਂਟ ਕੋਰ (PHF) ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਜੇਕਰ ਚਾਰ ਗੁਣਾਂ ਦੇ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਡੋਮੇਨ ਹਨ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੀ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। K18 ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ (ਚਿੱਤਰ 2e ਦੇਖੋ)।ਇਹ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ αS ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ-ਅਮੀਰ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਇੱਕ ਟਾਊ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਿਊਬਿਊਲ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, PHF ਖੇਤਰ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ (ਚਿੱਤਰ 2e ਦੇਖੋ), ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਲਾਈਸਿਨ (15% ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ) ਨਾਲ ਵੀ ਭਰਪੂਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਆ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਖੇਤਰ αS/Tau ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਸੰਘਣਾਕਰਨ ਵਿੱਚ ਵੀ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ K18 ਇਕੱਲੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਾਲਾਤਾਂ (15% PEG ਜਾਂ 20% dextran ਦੇ ਨਾਲ LLPS ਬਫਰ) (ਚਿੱਤਰ 2f) ਦੇ ਅਧੀਨ 100 μM ਤੱਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ LLPS ਨੂੰ ਟਰਿੱਗਰ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਸੀ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ 50 µM αS ਨੂੰ 50 µM K18 ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ, ਤਾਂ K18 ਅਤੇ αS ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਗਠਨ ਨੈਫੇਲੋਮੈਟਰੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 2d) ਅਤੇ WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (Fig. 2f) ਦੁਆਰਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ΔCt-αS K18 (Fig. 2f) ਦੇ LLPS ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਬਹਾਲ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਸੀ.ਅਸੀਂ ਨੋਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ αS/ΔNt-Tau ਜਾਂ αS/Tau441 ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ αS/K18 ਏਕੀਕਰਣ ਨੂੰ LLPS ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਥੋੜ੍ਹਾ ਉੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਹੋਰ ਚੀਜ਼ਾਂ ਬਰਾਬਰ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਹ ਮਾਈਕ੍ਰੋਟਿਊਬਿਊਲ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ-ਅਮੀਰ ਟਾਊ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਨਾਲ αS C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਦੇ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ 31।
ਇਹ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ΔNt-Tau αS ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ LLPS ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ Tau (isotype, Tau441/Tau441) ਦੇ ਨਾਲ LLPS ਸਿਸਟਮਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਸਰਲਤਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ αS/Tau LLPS ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਵਜੋਂ ਇਸ Tau ਰੂਪ ਨੂੰ ਚੁਣਿਆ ਹੈ।ਗੁੰਝਲਦਾਰ (ਹੀਟਰੋਟਾਈਪਿਕ, αS/Tau441) ਏਕੀਕਰਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।ਅਸੀਂ αS/Tau ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ αS ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ( ਸੰਘਣਾ ਪੜਾਅ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, fαS,c ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਵਜੋਂ) ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕੇਂਦਰੀਕਰਨ ਅਤੇ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ SDS-PAGE ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਵੇਖੋ 2e) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ, ਬਹੁਤ ਸਮਾਨ ਮੁੱਲ ਮਿਲੇ। ਇੱਕੋ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ.ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ αS/Tau ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਲਈ ਕ੍ਰਮਵਾਰ fαS,c 84 ± 2% ਅਤੇ 79 ± 7% ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ αS ਅਤੇ tau ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਭਿੰਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਟਾਊ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਨਾਲੋਂ ਉੱਤਮ ਹੈ।ਵਿਚਕਾਰ.
ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਅਤੇ αS ਕਾਇਨੇਟਿਕਸ 'ਤੇ ਸੰਘਣਾਪਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਪਹਿਲਾਂ ਫੋਟੋਬਲੀਚਿੰਗ (FRAP) ਵਿਧੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਰਿਕਵਰੀ ਦੁਆਰਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਸੀਂ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ਅਤੇ αS/pLK ਕੋਸਰਵੇਟਸ (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS ਅਤੇ 100 μM Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau ਜਾਂ 1 mM pLK ਨਾਲ ਪੂਰਕ) ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਮਿਲਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪਹਿਲੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ FRAP ਚਿੱਤਰਾਂ (Fig. 3a, αS/Tau441 ਸੰਘਣਾਪਣ) ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸਮਾਂ ਕੋਰਸ ਕਰਵ (Fig. 3b, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3) ਤੋਂ, ਇਹ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ αS ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ Tau441 coacervates ਦੇ ਸਮਾਨ ਹਨ।ਅਤੇ ΔNt-Tau, ਜੋ pLK ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਤੇਜ਼ ਹੈ।FRAP (Kang et al. 35 ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਨ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ αS ਲਈ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਸਾਰ ਗੁਣਾਂਕ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ਅਤੇ D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/Tau4 ਲਈ αS/Tα4 ਲਈ ਹਨ। αS/ ਸਿਸਟਮ।pLK, Tau, ਅਤੇ D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, ਕ੍ਰਮਵਾਰ (ਚਿੱਤਰ 3c)।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਾਰ ਗੁਣਾਂਕ αS ਸਾਰੇ ਸੰਘਣੇ ਪੜਾਵਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਕਈ ਆਦੇਸ਼ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕੋਰਲੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FCS, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 3 ਵੇਖੋ) ਉਸੇ ਹਾਲਤਾਂ (LLPS ਬਫਰ) ਦੇ ਅਧੀਨ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਪਰ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ( D = 8 ± 4 µm2/s)।ਇਸਲਈ, αS ਅਨੁਵਾਦ ਦੇ ਗਤੀਵਿਗਿਆਨ ਉਚਾਰੇ ਅਣੂ ਭੀੜ-ਭੜੱਕੇ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਫੈਲੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਾਰੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਆਪਣੇ ਗਠਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪਹਿਲੇ ਅੱਧੇ ਘੰਟੇ ਦੌਰਾਨ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ, ਟਾਊ ਪੜਾਅ ਦੇ ਉਲਟ।pLK ਕੰਡੈਂਸੇਟ ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ।
ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ αS ਡਾਇਨਾਮਿਕਸ (2% AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ αS) ਦਾ a–c FRAP ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।αS/Tau441 FRAP ਅਸੇਸ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਚਿੱਤਰ ਤ੍ਰਿਪਤੀ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ (a), ਜਿੱਥੇ ਲਾਲ ਚੱਕਰ ਰੰਗੀਨ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 5 µm ਹੈ।b ਔਸਤ FRAP ਵਕਰ ਅਤੇ (c) 100 µM αS ਅਤੇ Tau441 (ਲਾਲ) ਜਾਂ ΔNt-Tau (ਨੀਲਾ) ਜਾਂ pLK (ਹਰੇ) ਦੀ ਸਮਾਨਤਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ 5–6 (N) ਵੱਖ-ਵੱਖ ਬੂੰਦਾਂ ਲਈ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਫੈਲਾਅ ਗੁਣਾਂਕ (D) LLPS ਦੀ 10 ਗੁਣਾ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ.FRAP ਕਰਵ ਦਾ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਰੰਗਤ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਾਰ ਗੁਣਾਂਕ αS ਨੂੰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FCS) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਤਿਕੋਣੀ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਵਧੇਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਲਈ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਚਿੱਤਰ 3 ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇਖੋ)।d ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨ (ਕਾਲਾ) ਜਾਂ 100 μM Tau441 (ਲਾਲ) ਜਾਂ ΔNt-Tau (ਨੀਲਾ) ਜਾਂ 1 mM pLK (ਹਰਾ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ 100 μM TEMPOL-122-αS ਦਾ ਨਿਰੰਤਰ X-ਬੈਂਡ EPR ਸਪੈਕਟਰਾ।ਇਨਸੈੱਟ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਫੀਲਡ ਲਾਈਨਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਾਟਕੀ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।e 50 μM TEMPOL-122-αS ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਕਰ LLPS (ਕੋਈ PEG ਨਹੀਂ) ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।ਸਧਾਰਣ ਈਪੀਆਰ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਦੇ ਬੈਂਡ II (IIII/III) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਬੈਂਡ III ਦੇ ਘਟੇ ਹੋਏ ਐਪਲੀਟਿਊਡ ਨੂੰ Tau441 (ਲਾਲ), ΔNt-Tau (ਨੀਲਾ) ਅਤੇ pLK (ਹਰਾ) ਦੇ ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਰੰਗੀਨ ਰੇਖਾਵਾਂ ਹਰੇਕ ਕਰਵ 'ਤੇ n ਸਮਾਨ ਅਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮੋਟਾ ਬਾਈਡਿੰਗ ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡੇਟਾ ਲਈ ਫਿੱਟ ਦਿਖਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਇੱਕ ਪੂਰਕ ਵਜੋਂ, ਅਸੀਂ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਸਪਿਨ ਲੇਬਲਿੰਗ (SDSL) ਅਤੇ ਨਿਰੰਤਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਪੈਰਾਮੈਗਨੈਟਿਕ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ (CW-EPR) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ αS ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਇੱਕ ਯਥਾਰਥਵਾਦੀ ਬਕਾਇਆ ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ 36,37,38 ਦੇ ਨਾਲ IDP ਦੀ ਲਚਕਤਾ ਅਤੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਉਪਯੋਗੀ ਸਾਬਤ ਹੋਈ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿੰਗਲ Cys ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਵਿੱਚ ਸਿਸਟੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਨਿਰਮਾਣ ਕੀਤਾ ਅਤੇ 4-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸੀ-2,2,6,6-ਟੈਟਰਾਮੇਥਾਈਲਪਾਈਪੀਰੀਡੀਨ-ਐਨ-ਆਕਸੀਲ (TEMPOL) ਸਪਿਨ ਪੜਤਾਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਮਲੀਮਾਈਡ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵਜ਼ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਸਥਿਤੀ 122 ਜਾਂ 24 αS (TEMPOL-122-αS ਅਤੇ TEMPOL-24-αS) 'ਤੇ TEMPOL ਪੜਤਾਲਾਂ ਪਾਈਆਂ ਹਨ।ਪਹਿਲੇ ਕੇਸ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸਦੀ ਬਜਾਏ, ਸਥਿਤੀ 24 ਸਾਨੂੰ ਸੰਘਣਾਤਮਕ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਮੁੱਚੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਬਾਰੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦੇ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਦੋਵਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਫੈਲੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ EPR ਸਿਗਨਲ ਤੇਜ਼ ਗਤੀ ਵਾਲੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਨਾਈਟ੍ਰੋਆਕਸਾਈਡ ਰੈਡੀਕਲਸ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਹਨ।ਟਾਊ ਜਾਂ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau 1:1 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਜਾਂ 1:10 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ pLK) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਪੜਾਅ ਵੱਖ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਾਪੇਖਿਕ ਸਿਖਰ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। αS ਦਾ EPR ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ।ਨੁਕਸਾਨ ਦੀ ਰੇਖਾ ਚੌੜੀ ਹੋ ਗਈ, ਪਤਲੇ ਪੜਾਅ (ਚਿੱਤਰ 3d, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਘਟਾਏ ਗਏ αS ਪੁਨਰ-ਨਿਰਧਾਰਨ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਸਥਿਤੀ 122 'ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ। ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਥਿਤੀ 24 'ਤੇ pLK ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੇ ਪੜਤਾਲ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ, ਸਥਿਤੀ 122 'ਤੇ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਲਾਈਨ ਦੀ ਸ਼ਕਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲ ਗਈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a)।ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਸਪਿੱਨ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ IDP38,39 ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਨ ਲਈ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਆਈਸੋਟ੍ਰੋਪਿਕ ਮਾਡਲ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5a) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦੋ αS/ਪੋਲੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ 122 'ਤੇ ਸਪੈਕਟਰਾ ਦਾ ਮਾਡਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਪੈਕਟਰਾ ਦਾ ਪੁਨਰਗਠਨ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਰਹੇ।.24 ਸਪਿਨ ਕੰਟ੍ਰਾਸਟਸ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5a)।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ αS ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਦੇ ਸਪਿੱਨ ਸੰਰਚਨਾਵਾਂ ਦੀ ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਤਰਜੀਹੀ ਸਥਿਤੀਆਂ ਹਨ।ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ EPR ਹਾਲਤਾਂ (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, ਅਤੇ αS/pLK ਲਈ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 84 ± 2%, 79 ± 7%, ਅਤੇ 47 ± 4%) ਦੇ ਅਧੀਨ ਸੰਘਣੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ αS ਦੇ ਅੰਸ਼ ਨੂੰ ਵਿਚਾਰਦੇ ਹੋਏ — ਪੂਰਕ ਵੇਖੋ ਅੰਕੜਾ 2e ਡਾਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ c), ਇਹ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ EPR ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਵਿਸਤਾਰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਘਣਾ ਪੜਾਅ (TEMPOL-122- ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਮੁੱਖ ਬਦਲਾਅ) ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ αS ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ. αS), ਨਾ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣਾਪਣ।ਜਾਂਚ ਵਿੱਚ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵਿਸਕੋਸਿਟੀ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, LLPS ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਹੋਰ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ EPR ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ 1 M NaCl ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4b)।ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ CW-EPR ਦੁਆਰਾ ਖੋਜੀਆਂ ਗਈਆਂ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਘਣੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ αS ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਟਾਊ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ pLK ਨਾਲ ਵਧੇਰੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਪ੍ਰਤੀਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਕੋਸਰਵੇਟ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਰੇ ਹੋਰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਘੋਲ ਵਿੱਚ NMR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ LLPS ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਬਚੇ αS ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ ਕਿ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ NMR ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਘੋਲ ਦੇ ਤਲ 'ਤੇ ਇੱਕ ਸੰਘਣੀ ਪੜਾਅ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ NMR (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5c, d) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ LLPS ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਬਚੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਬਣਤਰ ਅਤੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ pLK ਅਤੇ ΔNt-Tau ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ ਇੱਕੋ ਜਿਹਾ ਵਿਵਹਾਰ ਕਰਦਾ ਸੀ, ਦੋਵੇਂ ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਅਤੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸਨ, ਸੈਕੰਡਰੀ ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟ ਅਤੇ R1ρ ਆਰਾਮ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।NMR ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ αS ਦਾ C-ਟਰਮਿਨਸ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਸਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਬਾਕੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਸਦੇ ਵਿਗਾੜਿਤ ਸੁਭਾਅ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਲਚਕਤਾ ਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਨੁਕਸਾਨ ਝੱਲਦਾ ਹੈ।
ਕਿਉਂਕਿ TEMPOL-122-αS ਸੰਘਣਾ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀਡਬਲਯੂ-ਈਪੀਆਰ ਸਿਗਨਲ ਵਿਸਤਾਰ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਐਲਐਲਪੀਐਸ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਨਾਲ αS ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਂਝ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ EPR ਟਾਈਟਰੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ (ਕੋਈ ਇਕੱਠਾ ਨਹੀਂ ਬਫਰ LLPS), ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਤਲੇ ਅਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਹਨ (ਜਿਸ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 4a ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6 ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ)।ਟੀਚਾ ਇਹ ਦੇਖਣਾ ਸੀ ਕਿ ਕੀ ਸਾਰੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ, ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਆਮ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਗੁਣਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਅਣੂ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਕਿਸੇ ਵੀ ਅੰਤਰੀਵ ਵਿਭਿੰਨ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਈਪੀਆਰ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਧਦੀ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਹੋ ਗਿਆ, ਲਗਭਗ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤਾ (ਚਿੱਤਰ 3e, ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 6) ਦੇ ਸਾਰੇ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੇ ਅਣੂ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਕਾਰਨ ਅਣੂ ਲਚਕਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।pLK ਨੇ ΔNt-Tau ਅਤੇ Tau441 ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਘੱਟ ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ (ਪੋਲੀਕੇਸ਼ਨ:αS) 'ਤੇ ਇਹ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, n ਸਮਾਨ ਅਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਮੰਨਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਬਾਈਡਿੰਗ ਮਾਡਲ ਦੇ ਨਾਲ ਡੇਟਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ pLK (~5 μM) ਦਾ ਪ੍ਰਤੱਖ ਵਿਭਾਜਨ ਸਥਿਰਤਾ Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau (~50 μM) ਤੋਂ ਘੱਟ ਤੀਬਰਤਾ ਦਾ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਹੈ ).µM)।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਇੱਕ ਮੋਟਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ αS ਦਾ ਨਿਰੰਤਰ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚਾਰਜ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸਰਲ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਉੱਚ ਸਾਂਝ ਹੈ।αS ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਇਸ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਤਰਲ ਗੁਣ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖਰੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ LSPT ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਤੋਂ ਪੀੜਤ ਹਨ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਭੀੜ-ਭੜੱਕੇ ਵਾਲੇ ਵਾਤਾਵਰਣ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਐਮੀਲੋਇਡ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਦੇ ਮੱਦੇਨਜ਼ਰ, ਅਸੀਂ ਸੰਭਵ LSPT ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ।BF ਅਤੇ CF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (ਚਿੱਤਰ 4) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ αS/Tau441 ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਕੋਸਰਵੇਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਵੱਡੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ਖੂਹ/ਸਲਾਇਡ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਸਤਹ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸੰਪਰਕ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਗਿੱਲੇ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7d);ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਥੱਲੇ ਬਣੇ ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ "ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰਾਫਟ" ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ।ਇਹ ਢਾਂਚੇ ਤਰਲ ਰਹੇ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਨੇ ਫਿਊਜ਼ ਕਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7b) ਅਤੇ LLPS ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕਈ ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 4 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7c)।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਪਦਾਰਥਾਂ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 7a) ਦੀ ਬਜਾਏ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਗਿੱਲਾ ਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪਸੰਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਸੰਤੁਲਿਤ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਲਈ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸਤਹ ਸੰਭਾਵੀ ਹਨ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, αS/ΔNt-Tau coalescence ਅਤੇ rafting ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ αS/pLK ਸੰਘਣੇਪਣ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 4)।ਛੋਟੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਸਮੇਂ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, αS/pLK ਬੂੰਦਾਂ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਸਤਹ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਗਿੱਲੇ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸਨ, ਪਰ ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਬੰਦ ਹੋ ਗਈ ਅਤੇ 5 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਿਰਫ ਸੀਮਤ ਸੰਯੋਜਨ ਘਟਨਾਵਾਂ ਅਤੇ ਕੋਈ ਗਿੱਲਾ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ।- ਜੈੱਲ-ਡ੍ਰਿਪ ਤਬਦੀਲੀ.
ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ BF (ਗ੍ਰੇਸਕੇਲ ਪੈਨਲ) ਅਤੇ CF (ਸੱਜਾ ਪੈਨਲ, ਹਰੇ ਵਿੱਚ AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ αS) 100 µM αS (1% ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਲੇਬਲ) ਵਾਲੇ ਕੋਸਰਵੇਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ 100 µM ਟੌਸਕੇਟੌਪ ਚਿੱਤਰ (Tau410pc) -ਟਾਊ (ਕੇਂਦਰ) ਜਾਂ 1 mM pLK (ਹੇਠਾਂ) ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਸਮੇਂ ਅਤੇ ਫੋਕਲ ਉਚਾਈਆਂ (z, ਪਲੇਟ ਦੇ ਤਲ ਤੋਂ ਦੂਰੀ)।ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਨਤੀਜੇ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ 4-6 ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।αS/Tau441 ਕੋਸਰਵੇਟਸ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਗਿੱਲੇ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਚਿੱਤਰ ਤੋਂ ਵੱਡੇ ਰਾਫਟ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਾਰੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਲਈ ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 20 µm ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਪੁੱਛਿਆ ਕਿ ਕੀ αS/Tau441 LLPS ਵਿੱਚ ਬਣੇ ਵੱਡੇ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਲ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਿਸੇ ਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਅਗਵਾਈ ਕਰਨਗੇ।ਅਸੀਂ WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੇ ਨਾਲ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ αS/Tau441 ਬੂੰਦਾਂ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦਾ ਪਾਲਣ ਕੀਤਾ ਜਿਵੇਂ ਉਪਰੋਕਤ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ, ਪਰ 1 μM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ αS ਅਤੇ Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ Tau441 (ਚਿੱਤਰ 5a) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਸੀਂ ਪੂਰੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਸੀਏ ਤੋਂ.5 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਰਾਫਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਵਧੇਰੇ ਤੀਬਰ ਗੈਰ-ਸਰਕੂਲਰ ਬਣਤਰ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਅਸੀਂ "ਪੁਆਇੰਟ" ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਨੂੰ αS ਨਾਲ ਸਮੂਹਿਕ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਕੁਝ Tau441 (ਚਿੱਤਰ 5a, ਚਿੱਟੇ ਤੀਰ) ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਇਹ ਧੱਬੇ ਹਮੇਸ਼ਾ αS/ΔNt-Tau ਲਈ αS/ΔNt-Tau ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਹੱਦ ਤੱਕ ਰਾਫਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਦੇਖੇ ਗਏ ਹਨ।pLK ਅਤੇ Tau ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਧੱਬੇ ਨਹੀਂ ਸਨ ਜੋ ਫਿਊਜ਼ਨ/ਗਿੱਲੇ ਲਈ ਅਯੋਗ ਸਨ।ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ αS ਅਤੇ Tau441 ਵਾਲੇ ਇਹ ਧੱਬੇ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਸਮੂਹ ਹਨ, ਅਸੀਂ CF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ Tau441 ਨੂੰ Atto647N ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 12.5 μM ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ thioflavin-T (ThT) ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂ ਤੋਂ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਰੰਗਹਾਲਾਂਕਿ αS/Tau441 ਬੂੰਦਾਂ ਜਾਂ ਰਾਫਟਾਂ ਦਾ ThT-ਦਾਗ 24 ਘੰਟੇ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੀ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 5b, ਚੋਟੀ ਦੀ ਕਤਾਰ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰਾਫਟਾਂ ਉੱਤੇ ਬਾਕੀ ਬਚੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ), ਰਾਫਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ Atto647N-Tau441 ਵਾਲੇ ThT-ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਬਣਤਰ ਬਹੁਤ ਕਮਜ਼ੋਰ ਸਨ।ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਿਤ ਚਟਾਕ (ਚਿੱਤਰ 5b, ਮੱਧ ਅਤੇ ਹੇਠਲੀ ਕਤਾਰਾਂ) ਦੇ ਆਕਾਰ, ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਸਥਾਨ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਚਟਾਕ ਉਮਰ ਦੇ ਤਰਲ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਬਣੇ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਸਮੂਹਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ।
LLPS buffer ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਪਲੇਟ ਦੇ ਇੱਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ 25 μM Tau441 (1 μM AF488-ਲੇਬਲ αS ਅਤੇ Atto647N-ਲੇਬਲਡ Tau441) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਸਮੇਂ ਅਤੇ ਫੋਕਲ ਉਚਾਈਆਂ (z, ਅਨਬਾਉਂਡ ਤਲ ਤੋਂ ਦੂਰੀ) 'ਤੇ WF 25 μM αS) .ਛੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੁਹਰਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-ਲੇਬਲਡ Tau441) ਅਤੇ 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 25 μM αS ਦਾ CF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪਿਕ ਚਿੱਤਰ।ਭਾਰ ਵਾਲੀਆਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਅਤੇ ਜਮ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰਾਫਟ ਅਤੇ ਚਟਾਕ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਉੱਪਰੀ ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰਲੀਆਂ ਕਤਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਹੇਠਲੀ ਕਤਾਰ 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ rafts ਅਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਚਿੱਟੇ ਤੀਰ ਦੋਵਾਂ ਪੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ ThT-ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਬਿੰਦੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਾਰੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਲਈ ਸਕੇਲ ਪੱਟੀ 20 µm ਹੈ।
ਤਰਲ ਤੋਂ ਠੋਸ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕੋਸਰਵੇਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਵਿਸਤਾਰ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਲਾਈਫਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ (FLIM) ਅਤੇ ਫੌਰਸਟਰ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਐਨਰਜੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FRET) (ਚਿੱਤਰ 6 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਅੰਕੜੇ 8 ਅਤੇ 9) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਪਰਤ ਦੀ ਕੋਸਰਵੇਟ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਇੱਕ ਵਧੇਰੇ ਸੰਘਣੀ ਜਾਂ ਠੋਸ-ਵਰਗੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਇਸ ਨਾਲ ਜੁੜੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪੜਤਾਲ ਵਿਚਕਾਰ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਸੰਪਰਕ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਾਂਚ ਦੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ (τ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਣ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। , ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ 40.,41,42.ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਡਬਲ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ (AF488 ਅਤੇ Atto647N ਕ੍ਰਮਵਾਰ FRET ਦਾਨੀ ਅਤੇ ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਰੰਗਾਂ ਵਜੋਂ), τ ਵਿੱਚ ਇਹ ਕਮੀ LSPT ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕੋਸਰਵੇਟ ਸੰਘਣਾਪਣ ਅਤੇ FRET(E) ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਵਾਧੇ ਦੇ ਨਾਲ ਵੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ LLPS αS/Tau441 ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਨਮੂਨਿਆਂ (LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ 25 µM 1 µM AF488 αS ਅਤੇ/ਜਾਂ Atto647N ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau) ਵਿੱਚ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਰਾਫਟ ਅਤੇ ਸਪਾਟ ਗਠਨ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ।ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਆਮ ਰੁਝਾਨ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ AF488 (τ488) ਅਤੇ Atto647N (τ647N) ਪੜਤਾਲਾਂ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਵਿੱਚ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਪਰਿਪੱਕ ਹੋਣ ਦੇ ਨਾਲ ਥੋੜ੍ਹਾ ਘੱਟ ਗਿਆ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 6 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8c)।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਇਸ ਤਬਦੀਲੀ ਨੂੰ ਰਾਫਟ (ਚਿੱਤਰ 6c) ਦੇ ਅੰਦਰ ਬਿੰਦੀਆਂ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਬਿੰਦੀਆਂ 'ਤੇ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣਾਪਣ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਸਮਰਥਨ ਵਿੱਚ, 24 ਘੰਟੇ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8d) ਲਈ ਉਮਰ ਦੀਆਂ αS/ΔNt-Tau ਬੂੰਦਾਂ ਲਈ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤਬਦੀਲੀ ਨਹੀਂ ਵੇਖੀ ਗਈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਜੈਲੇਸ਼ਨ ਇੱਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੈ ਜੋ ਸਪੌਟਿੰਗ ਤੋਂ ਵੱਖਰੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਅਣੂ ਪੁਨਰਗਠਨ ਦੇ ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੇ ਅੰਦਰ.ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ αS ਵਿੱਚ ਬਿੰਦੀਆਂ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਵੇਰੀਏਬਲ ਸਮੱਗਰੀ ਹਨ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ αS/Tau441 ਸਿਸਟਮ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8e) ਲਈ।ਸਪਾਟ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ Atto647N ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ Tau441 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8a), ਅਤੇ αS/Tau441 ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦੋਵਾਂ ਲਈ ਉੱਚ FRET ਕੁਸ਼ਲਤਾਵਾਂ, ਪੰਜ ਪੀਐਸ ਘੰਟਿਆਂ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਚਾਲੂ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਥਿਰ ਬਿਜਲੀ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੰਘਣਾ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।αS/ΔNt-Tau ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ αS/Tau441 ਸਥਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਘੱਟ τ647N ਅਤੇ ਕੁਝ ਉੱਚੇ τ488 ਮੁੱਲ ਦੇਖੇ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹੇਠਲੇ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਅਸੰਗਤ FRET ਮੁੱਲ ਹਨ।ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਇਸ ਤੱਥ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ αS/Tau441 ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ, ਸਮੁੱਚੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਗਈ αS ਭਰਪੂਰਤਾ ਵਧੇਰੇ ਵਿਪਰੀਤ ਹੈ, ਅਕਸਰ ਟਾਊ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਸਬਸਟੋਚਿਓਮੀਟ੍ਰਿਕ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ Tau441 ਖੁਦ ਵੀ LLPS ਅਤੇ ਏਕੀਕਰਣ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 8e) .ਹਾਲਾਂਕਿ, ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਸੰਯੋਜਨ ਦੀ ਡਿਗਰੀ, ਬੇੜਾ ਬਣਨਾ, ਅਤੇ, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣਾ ਅਧਿਕਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ Tau441 ਅਤੇ αS ਦੋਵੇਂ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ 25 μM (1 μM AF488-ਲੇਬਲ αS ਅਤੇ 1 μM Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau LLPS buff) ਵਿੱਚ αS/Tau441 ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਦੀਆਂ ਲਾਈਫਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FLIM) ਤਸਵੀਰਾਂ।ਕਾਲਮ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਸਮਿਆਂ (30 ਮਿੰਟ, 5 ਘੰਟੇ ਅਤੇ 24 ਘੰਟੇ) 'ਤੇ LLPS ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧ ਚਿੱਤਰ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਲਾਲ ਫਰੇਮ αS/Tau441 ਚਟਾਕ ਵਾਲਾ ਖੇਤਰ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਨੂੰ ਰੰਗ ਪੱਟੀ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ.ਸਾਰੇ ਚਿੱਤਰਾਂ ਲਈ ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 20 µm।b ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਖੇਤਰ ਦੀ FLIM ਚਿੱਤਰ ਨੂੰ ਜ਼ੂਮ-ਇਨ ਕਰੋ, ਪੈਨਲ a ਵਿੱਚ ਲਾਲ ਬਕਸੇ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜੀਵਨ ਰੇਂਜਾਂ ਨੂੰ ਪੈਨਲ ਏ ਵਾਂਗ ਰੰਗ ਸਕੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ = 5 µm।c ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ (ਡਰੋਪਲੇਟ-ਡੀ-, ਰਾਫਟ-ਆਰ- ਅਤੇ ਸਪੇਕਲ-ਪੀ) ਲਈ AF488 (αS ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ) ਜਾਂ Atto647N (Tau ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ Tau441 ਦੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਅਤੇ αS- ਲਈ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ FLIM ਚਿੱਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਅਤੇ αS/ΔNt-Tau ਕੋਸਰਵੇਟ ਨਮੂਨੇ (D ਲਈ N = 17-32 ROI, R ਲਈ 29-44 ROI, ਅਤੇ ਪੁਆਇੰਟਾਂ ਲਈ 21-51 ROI)।ਮੱਧਮਾਨ ਅਤੇ ਮੱਧਮਾਨ ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਬਕਸੇ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪੀਲੇ ਵਰਗ ਅਤੇ ਕਾਲੀਆਂ ਲਾਈਨਾਂ ਵਜੋਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਬਕਸੇ ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਅਤੇ ਉੱਪਰਲੇ ਸੀਮਾ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪਹਿਲੇ ਅਤੇ ਤੀਜੇ ਚੌਥਾਈ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ 1.5-ਗੁਣਾ ਇੰਟਰਕੁਆਰਟਾਈਲ ਰੇਂਜ (IQR) ਦੇ ਅੰਦਰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਮੂਹ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਆਊਟਲੀਅਰ ਕਾਲੇ ਹੀਰੇ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਡਿਸਟਰੀਬਿਊਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਜੋੜਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਕੜਾ ਮਹੱਤਵ ਨੂੰ ਅਸਮਾਨ ਵਿਭਿੰਨਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਮੰਨਦੇ ਹੋਏ, ਦੋ-ਨਮੂਨਾ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ p-ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਦੇ ਹਰੇਕ ਜੋੜੇ ਲਈ ਤਾਰੇ ਦੇ ਨਾਲ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (* p-ਮੁੱਲ > 0.01, ** p-ਮੁੱਲ > 0.001, *** p-ਮੁੱਲ > 0.0001, **** p-ਮੁੱਲ > 0.00001), ns ਅਣਗਹਿਲੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ (p-ਮੁੱਲ > 0.05)।ਸਹੀ p ਮੁੱਲ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1 ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਅਤੇ ਮੂਲ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਸਪੈਕਲਸ/ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦੀ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਨੂੰ ਹੋਰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ (1 M) NaCl ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਬੇਦਾਗ ਕੋਸਰਵੇਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਤੋਂ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਜਦੋਂ ਪਰਮਾਣੂ ਬਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (AFM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਐਗਰੀਗੇਟਸ (ਭਾਵ, ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦਾ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਘੋਲ) ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਲਗਭਗ 15 nm ਦੀ ਨਿਯਮਤ ਉਚਾਈ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੋਲਾਕਾਰ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਦੇਖਿਆ, ਜੋ ਉੱਚ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇ ਕਾਰਨ ਆਮ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਦਾ ਵਿਵਹਾਰ (ਨੋਟ ਕਰੋ ਕਿ ਫਾਈਬਰਿਲਾਂ ਦੀ ਉਚਾਈ ~10 nm ਹੁੰਦੀ ਹੈ) (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 10a)।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਜਦੋਂ ਇੱਕ ਸਟੈਂਡਰਡ ThT ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਸਮੁੱਚੀਆਂ ਨੂੰ ThT ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ThT ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕੁਆਂਟਮ ਉਪਜ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨਾਟਕੀ ਵਾਧਾ ਦੇਖਿਆ, ਜਦੋਂ ਡਾਈ ਨੂੰ ਆਮ αS ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ (ਪੂਰਕ F10b) ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਦੇ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਕੋਸਰਵੇਟ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ ਵਰਗੀ ਬਣਤਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।.ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਉੱਚ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲ ਸਨ ਪਰ 4 M guanidine ਕਲੋਰਾਈਡ (GdnHCl) ਪ੍ਰਤੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਸਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਆਮ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 10c)।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਸਿੰਗਲ ਮੋਲੀਕਿਊਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ, ਖਾਸ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕੋਰੀਲੇਸ਼ਨ/ਕਰਾਸ-ਕੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟਰੋਸਕੋਪੀ (FCS/FCCS), ਅਤੇ ਦੋ-ਰੰਗਾਂ ਦੇ ਇਤਫ਼ਾਕ ਖੋਜ (TCCD) ਦੇ ਬਰਸਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਮੂਹਾਂ ਦੀ ਰਚਨਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।ਇਸ ਅੰਤ ਲਈ, ਅਸੀਂ 100 μl LLPS ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਦੇ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ αS ਅਤੇ Tau441 (ਦੋਵੇਂ 25 μM) ਦੇ ਨਾਲ 1 μM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ αS ਅਤੇ 1 μM Atto647N-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ Tau441 ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤਾ।LLPS ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿਚਕਾਰ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸੰਭਾਵਿਤ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਉਸੇ PEG-ਮੁਕਤ ਬਫਰ ਅਤੇ 1 M NaCl (ਉਹੀ ਬਫਰ ਜੋ ਕੋਸਰਵੇਟ ਤੋਂ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਫੈਲੇ ਹੋਏ ਕੁੱਲ ਘੋਲ ਨੂੰ ਮੋਨੋਮੋਲੀਕੂਲਰ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ।ਇੱਕ ਅਣੂ ਦੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਟ੍ਰੈਜੈਕਟਰੀ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਚਿੱਤਰ 7a ਵਿੱਚ ਵੇਖੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।FCCS/FCS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਕਰਾਸ-ਸਬੰਧ, CC ਅਤੇ ਆਟੋਕੋਰਲੇਸ਼ਨ, AC) ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ αS ਅਤੇ tau ਵਾਲੇ ਸਮਗਰੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 7b, ਖੱਬੇ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ CC ਕਰਵ ਵੇਖੋ), ਅਤੇ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੱਕ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਇਆ। ਪੇਤਲੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਨਤੀਜਾ (ਚਿੱਤਰ 7b, ਖੱਬੇ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ AC ਕਰਵ ਵੇਖੋ)।ਕੇਵਲ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕੋ ਹੱਲ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਸੀਸੀ ਕਰਵ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਈ ਦਿੱਤੇ, ਅਤੇ AC ਕਰਵ ਇੱਕ-ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਫੈਲਾਅ ਮਾਡਲ (Eq. 4) ਦੇ ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਫਿੱਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿੱਥੇ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵਿਤ ਪ੍ਰਸਾਰ ਗੁਣਾਂਕ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 7b) ), ਸੱਜਾ ਪੈਨਲ)।ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਣਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰ ਗੁਣਾਂਕ 1 µm2/s ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਅਤੇ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦਾ ਲਗਭਗ 1 µm2/s ਹੈ।50–100 µm/s;ਮੁੱਲ ਸੋਨੀਕੇਟਡ αS ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਜ਼ ਅਤੇ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ αS ਲਈ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਮੁੱਲਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹਨ ਜੋ ਸਮਾਨ ਹੱਲ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਨ44।ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਟੀਸੀਸੀਡੀ ਵਿਸਫੋਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਚਿੱਤਰ 7c, ਚੋਟੀ ਦੇ ਪੈਨਲ) ਦੇ ਨਾਲ ਸਮੁੱਚਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਹਰੇਕ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਐਗਰੀਗੇਟ (αS/Tau heteroaggregate) ਵਿੱਚ, ਲਗਭਗ 60% ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ αS ਅਤੇ tau ਦੋਵੇਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਲਗਭਗ 30% ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। tau, ਲਗਭਗ 10% αS ਸਿਰਫ਼।αS/Tau heteroaggregates ਦੇ Stoichiometric ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ heteroaggregates ਤਾਊ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸਨ (0.5 ਤੋਂ ਘੱਟ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟਰੀ, ਪ੍ਰਤੀ ਸਮੁੱਚੀ ਟਾਊ ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਔਸਤ ਸੰਖਿਆ αS ਅਣੂਆਂ ਨਾਲੋਂ 4 ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਹੈ), ਜੋ ਕਿ FLIM ਵਿੱਚ ਵੇਖੇ ਗਏ ਸਾਡੇ ਕੰਮ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ। ਪ੍ਰਯੋਗ.FRET ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਕੇਸ ਵਿੱਚ ਅਸਲ FRET ਮੁੱਲ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵ ਦੇ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਹਰ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਫੋਰਸ ਦੀ ਵੰਡ ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਰਹਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਣ ਕਾਰਨ ਬੇਤਰਤੀਬ ਸੀ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ 45,46 ਪਰਿਪੱਕ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ-ਘਾਟ ਟਾਊ ਵੇਰੀਐਂਟ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 11a,b ਵੇਖੋ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਉਹੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ αS ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਉਹੀ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 11c, d), ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਏਗਰੀਗੇਟਸ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ FLIM ਨੇ ਸਿਟੂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕਈ ਥਾਂਵਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ, ਅਤੇ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਸਮੁੱਚੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ ਕਮਜ਼ੋਰ ਅੰਤਰ-ਸਬੰਧੀ ਕਰਵ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਮੂਹਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਿਹੀ ਸੰਖਿਆ ਲਈ (Tau441 ਦਾ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਦਸਵਾਂ ਹਿੱਸਾ), ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ ਹਰ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਇਸ Tau ਰੂਪ ਨਾਲੋਂ αS ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਲਗਭਗ 50% ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ αS ਅਣੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ αS ਵਾਧੂ ਵਿੱਚ ਵਿਪਰੀਤ ਸੀ। .Tau441 (Fig. 6f) ਦੁਆਰਾ ਉਤਪੰਨ ਵਿਪਰੀਤ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਉਲਟ, ਸਮੂਹ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 11e ਦੇਖੋ)।ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ αS ਖੁਦ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਤਾਊ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਦੇ ਸਮਰੱਥ ਹੈ, ਇਹਨਾਂ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਟਾਊ ਨਿਊਕਲੀਏਸ਼ਨ ਵਧੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਸਮੂਹ αS ਅਤੇ tau ਦੇ ਰੂਪ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇੱਕ ਵਾਰ ਇੱਕ ਤਾਊ-ਅਮੀਰ ਕੋਰ ਬਣ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, αS ਅਤੇ tau ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਪਰੀਤ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਤਾਊ ਅਣੂਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਹੋਮੋਟਾਈਪਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ;ਅਸੀਂ ਤਰਲ αS/tau coacervates ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈੱਟਵਰਕਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਦੇਖਦੇ ਹਾਂ।
αS/Tau441 ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਬਣੇ ਆਈਸੋਲੇਟਿਡ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਟੈਂਪੋਰਲ ਟਰੇਸ।αS/Tau441 ਕੋਅਗਰੀਗੇਟਸ (ਸੰਕੇਤ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਬਰਸਟ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਬਰਸਟਾਂ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਖੋਜ ਚੈਨਲਾਂ (ਐਫ਼488 ਅਤੇ Atto647N ਨਿਕਾਸੀ ਸਿੱਧੇ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨੀਲੀਆਂ ਅਤੇ ਲਾਲ ਲਾਈਨਾਂ, ਅਸਿੱਧੇ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ Atto647N ਨਿਕਾਸੀ), FRET, ਵਾਇਲੇਟ ਲਾਈਨ) ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ।b LLPS (ਖੱਬੇ ਪੈਨਲ) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ αS/Tau441 ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਦਾ FCS/FCCS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।AF488 ਅਤੇ Atto647N ਲਈ ਆਟੋਕੋਰਿਲੇਸ਼ਨ (AC) ਕਰਵ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਨੀਲੇ ਅਤੇ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ, ਅਤੇ ਦੋਨਾਂ ਰੰਗਾਂ ਵਾਲੇ ਸਮੂਹਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਕਰਾਸ-ਸਬੰਧ (CC) ਕਰਵ ਜਾਮਨੀ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।AC ਕਰਵ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਅਤੇ ਐਗਰੀਗੇਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ CC ਕਰਵ ਸਿਰਫ ਡਬਲ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦਾ ਫੈਲਾਅ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਉਹੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਪਰ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਹੱਲ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਸਥਾਨਾਂ ਵਿੱਚ, ਸਿਰਫ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ αS ਅਤੇ Tau441 ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਸੱਜੇ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।c αS/Tau441 ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਬਣੇ ਆਈਸੋਲੇਟਿਡ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਅਣੂਆਂ ਦਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਫਲੈਸ਼ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।ਚਾਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਦੁਹਰਾਓ (N = 152) ਵਿੱਚ ਪਾਈ ਗਈ ਹਰੇਕ ਸਮੁੱਚੀ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟਰੀ, S ਮੁੱਲਾਂ, ਅਤੇ FRET ਕੁਸ਼ਲਤਾ (ਚੋਟੀ ਦੇ ਪੈਨਲ, ਰੰਗ ਪੱਟੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ) ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪਲਾਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਤਿੰਨ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ: S~1 ਅਤੇ FRET~0 ਦੇ ਨਾਲ -αS-ਸਿਰਫ ਐਗਰੀਗੇਟਸ, S~0 ਅਤੇ FRET~1 ਦੇ ਨਾਲ Tau-ਸਿਰਫ ਐਗਰੀਗੇਟਸ, ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰਲੇ S ਅਤੇ FRET ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਪਰੀਤ Tau/αS ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਨੁਮਾਨ ਹਰੇਕ ਵਿਪਰੀਤ ਕੁਲ (N = 100) ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਗਏ ਦੋਵੇਂ ਮਾਰਕਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੇਠਲੇ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ (ਰੰਗ ਦਾ ਪੈਮਾਨਾ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ)।ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਕੱਚਾ ਡੇਟਾ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਤਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਜਾਂ ਬੁਢਾਪੇ ਨੂੰ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਜੈੱਲ-ਵਰਗੇ ਜਾਂ ਠੋਸ ਢਾਂਚਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸੰਘਣਾ ਕਰਨਾ ਸੰਘਣਾਪਣ 47 ਦੇ ਕਈ ਸਰੀਰਕ ਕਾਰਜਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਬਿਮਾਰੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ 7, 48, 49 ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਅਸਧਾਰਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਜੋਂ। ਅਸੀਂ ਪੜਾਅ ਦੇ ਵਿਛੋੜੇ ਅਤੇ ਵਿਹਾਰ ਦਾ ਵਿਸਥਾਰ ਨਾਲ ਅਧਿਐਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਘੱਟ ਮਾਈਕ੍ਰੋਮੋਲਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਸਰੀਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ LSPT αS (ਨੋਟ ਕਰੋ ਕਿ αS ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸਰੀਰਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ >1 µM50 ਹੈ), LPS ਦੇ ਆਮ ਥਰਮੋਡਾਇਨਾਮਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਲਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਵਿਵਹਾਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ αS, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਰੀਰਕ pH 'ਤੇ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚਾਰਜ ਵਾਲਾ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ pLK ਜਾਂ Tau ਵਰਗੇ ਉੱਚ cationic ਵਿਗਾੜ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ LLPS ਦੁਆਰਾ ਜਲਮਈ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਅਮੀਰ ਬੂੰਦਾਂ ਬਣਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸੰਘਣਾਪਣ।ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਸੈਲੂਲਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਢੁਕਵੇਂ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਜਿੱਥੇ αS ਵਿਟਰੋ ਅਤੇ ਵੀਵੋ 51,52,53,54 ਦੋਵਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦੇ ਰੋਗ-ਸਬੰਧਤ ਏਕੀਕਰਣ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਿਕ ਅਣੂਆਂ ਦਾ ਸਾਹਮਣਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ, ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਮੁੱਖ ਕਾਰਕਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਮੰਨਿਆ ਗਿਆ ਹੈ 55,56।ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ αS ਵਿੱਚ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਤਾਕਤ, ਵੈਲੈਂਸ, ਅਤੇ ਇਹਨਾਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਬਹੁਲਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਸੰਤੁਲਨ ਸਿਧਾਂਤ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਦੋ ਤਰਲ ਅਵਸਥਾਵਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਸੰਤੁਲਨ ਲੈਂਡਸਕੇਪ ਬਾਇਓਪੌਲੀਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਅਮੀਰ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਬੂੰਦ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਹੋਵੇਗੀ ਜੋ LLPS57,58 ਨੂੰ ਚਲਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਵਾਧਾ ਓਸਟਵਾਲਡ ਪਰਿਪੱਕਤਾ 59, ਕੋਲੇਸੈਂਸ 60 ਜਾਂ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ61 ਵਿੱਚ ਮੁਫਤ ਮੋਨੋਮਰ ਦੀ ਖਪਤ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।αS ਅਤੇ Tau441, ΔNt-Tau ਜਾਂ pLK ਲਈ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਸੰਘਣੇਪਣ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦਰਿਤ ਸਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਪੂਰੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਟਾਊ ਬੂੰਦਾਂ ਸਤਹ ਗਿੱਲੇ ਹੋਣ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਇਕੱਠੀਆਂ ਹੋ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ, ΔNT-Tau ਅਤੇ pLK ਲਈ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਸੰਯੁਕਤ ਹੋਣਾ ਅਤੇ ਗਿੱਲਾ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਸੀ, ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਤਰਲ ਗੁਣਾਂ ਦੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਨੁਕਸਾਨ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਸਾਡੇ FLIM-FRET ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਬਿਰਧ pLK ਅਤੇ ΔNt-Tau ਬੂੰਦਾਂ ਨੇ ਮੂਲ ਬੂੰਦਾਂ ਵਾਂਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ (ਸਮਾਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਲਾਈਫਟਾਈਮ) ਦੀ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਡਿਗਰੀ ਦਿਖਾਈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਵਧੇਰੇ ਸਖ਼ਤ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਮਾਡਲ (ਚਿੱਤਰ 8) ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਤਰਕਸੰਗਤ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਸਥਾਈ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਣੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਅਕਸਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਮੁਆਵਜ਼ੇ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਚਾਰਜ ਅਸੰਤੁਲਨ ਦੇ ਖੇਤਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਇੰਟਰਫੇਸ 'ਤੇ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਉੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸਤਹ ਸੰਭਾਵੀ ਨਾਲ ਬੂੰਦਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਚਾਰਜ (ਇੱਕ ਵਰਤਾਰੇ ਜਿਸਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੈਲੈਂਸ ਡਿਪਲੇਸ਼ਨ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਦੀ ਪੂਰਤੀ ਕਰਨ ਅਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਦੀ ਸਤਹ ਸੰਭਾਵੀ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ, ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਪਤਲੇ ਪੜਾਅ ਤੋਂ ਨਵੇਂ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਇਡਸ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਚਾਰਜ-ਚਾਰਜ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈੱਟਵਰਕਾਂ ਨੂੰ ਪੁਨਰਗਠਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਬੂੰਦਾਂ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਸਤਹ (ਗਿੱਲੇ) ਦੇ ਨਾਲ.αS/pLK ਬੂੰਦਾਂ, ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ (ਕੇਵਲ αS ਅਤੇ pLK ਵਿਚਕਾਰ ਹੀਟਰੋਟਾਈਪਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸਾਂਝ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਸੰਘਣਾਪਣ ਦੇ ਚਾਰਜ ਨੂੰ ਹੋਰ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਜਾਪਦੇ ਹਨ;ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ αS/Tau ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਣੇ αS/pLK ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਦੇਖਿਆ।ਵੈਲੈਂਸ ਦੀ ਕਮੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆਵਾਂ ਘੱਟ ਸਮੇਂ ਲਈ ਬਣ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਆਪਣੇ ਤਰਲ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਗੁਆ ਦਿੰਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਘੱਟ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸਤਹ ਸੰਭਾਵੀ (ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਸਤ੍ਹਾ ਨੂੰ ਗਿੱਲਾ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ) ਵਾਲੀਆਂ ਜੈੱਲ ਵਰਗੀਆਂ, ਗੈਰ-ਜਲਣਸ਼ੀਲ ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਸਦੇ ਉਲਟ, αS/Tau ਬੂੰਦਾਂ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕਾਂ (ਹੋਮੋਟਾਈਪਿਕ ਅਤੇ ਹੇਟਰੋਟਾਈਪਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਕਮਜ਼ੋਰ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਬੂੰਦ ਚਾਰਜ ਸੰਤੁਲਨ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਕੁਸ਼ਲ ਹਨ।ਇਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਬੂੰਦਾਂ ਨਿਕਲਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਤਰਲ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਉੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸਤਹ ਸੰਭਾਵੀ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਕੋਲੇਸਿੰਗ ਅਤੇ ਵਧਣ (ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਸਤਹ ਖੇਤਰ/ਆਵਾਜ਼ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ) ਅਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਸਤਹ ਰਸਾਇਣ ਨੂੰ ਗਿੱਲਾ ਕਰਕੇ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵੱਡੀਆਂ ਕੇਂਦਰਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਤਰਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਵਿੱਚ ਚਾਰਜ ਅਨੁਕੂਲਨ ਲਈ ਨਿਰੰਤਰ ਖੋਜ ਦੇ ਕਾਰਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਬਹੁਤ ਅਸਥਾਈ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, Tau ਦੇ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਰੂਪ, ਕੁਝ ਕੁਦਰਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੋਣ ਵਾਲੇ isoforms62 ਸਮੇਤ, ਵਿਚਕਾਰਲੇ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਕੁਝ αS ਦੇ ਨਾਲ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਚੱਲਣ ਵਾਲੀਆਂ ਜੈੱਲ-ਵਰਗੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਬੁਢਾਪੇ ਦੇ ਨਾਲ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਦੂਸਰੇ ਵੱਡੇ ਤਰਲ ਸੰਘਣੇਪਣ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।αS ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਵਿੱਚ ਇਹ ਦਵੈਤ ਹਾਲ ਹੀ ਦੇ LLPS ਸਿਧਾਂਤਕ ਅਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ ਸੰਘਣੇ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਤਰਲ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕੁੰਜੀ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੰਡੈਂਸੇਟ ਵਿੱਚ ਵੈਲੈਂਸ ਡਿਪਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸਿਵਿੰਗ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਵਿਧੀ 58.61.
ਇਹ ਸਕੀਮ LLPS ਅਤੇ LSPT ਦੁਆਰਾ αS ਅਤੇ Tau441 ਲਈ ਪੁਟੇਟਿਵ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਮਾਰਗ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਵਾਧੂ ਐਨਾਇਨ-ਅਮੀਰ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਕੈਟੇਸ਼ਨ-ਅਮੀਰ (ਨੀਲੇ) ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ, ਤਸੱਲੀਬਖਸ਼ ਵੈਲੈਂਸ ਵਾਲੇ αS ਅਤੇ ਟਾਊ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੀ ਸਤਹ ਊਰਜਾ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਘੱਟ ਇਕਸੁਰਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਤੇਜ਼ ਬੂੰਦਾਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਧਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਗੈਰ-ਸੰਗਠਿਤ ਜੈੱਲ ਅਵਸਥਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ..ਇਹ ਸਥਿਤੀ αS/pLK ਸਿਸਟਮ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਸਾਂਝ ਅਤੇ ਸਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਜੋੜਾ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੇ ਕਾਰਨ ਬਹੁਤ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ, ਜੋ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਜੈੱਲ-ਵਰਗੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਅਸੰਤੋਸ਼ਜਨਕ ਸੰਤੁਲਨ ਵਾਲੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਅਤੇ, ਇਸਲਈ, ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ ਉਪਲਬਧ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ, ਕੋਸਰਵੇਟ ਲਈ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਸਤਹ ਨੂੰ ਫਿਊਜ਼ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਗਿੱਲਾ ਕਰਨਾ ਆਸਾਨ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਸਤਹ ਊਰਜਾ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।ਇਹ ਸਥਿਤੀ αS/Tau441 coacervates ਲਈ ਤਰਜੀਹੀ ਹੈ, ਜਿਹਨਾਂ ਕੋਲ ਇੱਕ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੈਟਵਰਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕਮਜ਼ੋਰ Tau-Tau ਅਤੇ αS-Tau ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ, ਵੱਡੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਆਪਣੇ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਗੁਣਾਂ ਨੂੰ ਹੋਰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਣਗੇ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਤੋਂ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆਵਾਂ ਹੋਣਗੀਆਂ।ਆਖਰਕਾਰ, ਕੋਸਰਵੇਟ ਤਰਲ ਦੇ ਅੰਦਰ αS ਅਤੇ tau ਦੋਨਾਂ ਨੂੰ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਐਮੀਲੋਇਡ ਵਿਪਰੀਤ ਸਮੂਹ, ਜੋ ਕਿ ਸੰਮਿਲਨ ਸਰੀਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਲੋਕਾਂ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਟਿਵ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਲੱਛਣ ਹਨ।
ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਭੀੜ-ਭੜੱਕੇ ਵਾਲੇ ਪਰ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਤਾਵਰਨ ਦੇ ਨਾਲ αS/Tau441 ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੌਰਾਨ ਬਣੀਆਂ ਵੱਡੀਆਂ ਤਰਲ-ਵਰਗੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਅਤੇ, ਕੁਝ ਹੱਦ ਤੱਕ, αS/ΔNt-Tau ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਕੱਤਰੀਕਰਨ ਦੇ ਨਿਊਕਲੀਏਸ਼ਨ ਲਈ ਆਦਰਸ਼ ਭੰਡਾਰ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਠੋਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਕਸਰ αS ਅਤੇ tau ਦੋਵੇਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਹੈਟਰੋਐਗਰੀਗੇਟ ਗੈਰ-ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਆਮ ਐਮੀਲੋਇਡ ਫਾਈਬਰਿਲਸ ਵਾਂਗ ਹੀ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ThT ਰੰਗਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਵਿਰੋਧ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।LLPS ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ αS/tau ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ ਵਰਗੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।ਦਰਅਸਲ, ਤਰਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਕੋਸਰਵੇਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇਹਨਾਂ ਵਿਭਿੰਨ αS ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਵਿੱਚ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਟਾਊ ਦੀ ਘਾਟ ਦਾ ਪਰਿਪੱਕ ਰੂਪ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੈ।αS/Tau441 ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਦਾ ਗਠਨ ਸਿਰਫ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਦੇ ਅੰਦਰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਸਨ, ਅਤੇ ਕਦੇ ਨਹੀਂ, ਜੇਕਰ ਕੋਸਰਵੇਟਸ/ਬੂੰਦਾਂ ਜੈੱਲ ਅਵਸਥਾ ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਪਹੁੰਚਦੀਆਂ ਸਨ।ਬਾਅਦ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਤਾਕਤ ਅਤੇ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੀ ਕਠੋਰਤਾ ਐਮੀਲੋਇਡ ਨਿਊਕਲੀਏਸ਼ਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਨਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਸਥਾਪਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਪੁਨਰਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਵਧੇਰੇ ਲਚਕਦਾਰ, ਤਰਲ-ਵਰਗੇ ਕੋਸਰਵੇਟਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ ਤਰਲ ਰਹਿਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਆਕਾਰ ਵਿੱਚ ਵਧਦੇ ਹਨ।
ਇਹ ਤੱਥ ਕਿ ਸੰਘਣਾ ਪੜਾਅ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਮੂਹਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਛੋਟੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਡੀਆਂ αS/Tau ਸੰਘਣੀਆਂ ਵਿੱਚ ਤਰਜੀਹੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਜੈੱਲ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਉਹਨਾਂ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੀ ਸਾਰਥਕਤਾ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਸੰਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਨਾ ਸਿਰਫ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਹੈ, ਪਰ ਸੰਘਣੇਪਣ ਦੇ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਸਹੀ ਕੰਮ ਕਰਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਬਿਮਾਰੀ ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਲਈ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ58,61।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ αS/Tau ਸਿਸਟਮ ਲਈ LLPS ਅਤੇ LSPT ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਤੁਲਨ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਵੀ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਜਦੋਂ ਕਿ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਗਠਨ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ ਉਪਲਬਧ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੋਨੋਮਰਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੋਰ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ 63,64 ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਉੱਚ ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ 'ਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਦਾ ਫਿਊਜ਼ਨ ਹੌਲੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਪੁਨਰਗਠਨ ਦੁਆਰਾ ਅੰਦਰੂਨੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈੱਟਵਰਕ..
ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ LSPT ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ ਡ੍ਰੌਪ ਨੈਟਵਰਕਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕਸੁਰਤਾ ਵਾਲੀ ਸੰਪੂਰਨਤਾ ਅਤੇ ਸੰਤੁਸ਼ਟ/ਅਸੰਤੁਸ਼ਟ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਸਾਰਥਕਤਾ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ αS/Tau441 ਕੰਡੈਂਸੇਟ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਏਟ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਐਮੀਲੋਇਡ-ਵਰਗੇ ਹੈਟਰੋਐਗਰੀਗੇਟਸ ਬਣਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੋਵੇਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸਾਡੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਅਣੂ ਵਿਧੀ ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵ ਕਰਦੇ ਹਨ।αS/Tau ਤਰਲ ਕੋਸਰਵੇਟ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦਾ ਸਹਿ-ਏਕੀਕਰਨ ਜਿਸਦੀ ਅਸੀਂ ਇੱਥੇ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਸੰਮਿਲਨ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਸਹਿ-ਸਥਾਨੀਕਰਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਲੱਛਣ ਹਨ, ਅਤੇ LLPS ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਐਮੀਲੋਇਡ ਐਗਰੀਗੇਸ਼ਨ, ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਚਾਰਜ ਵਾਲੇ IDP ਲਈ ਰਾਹ ਪੱਧਰਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ਅਤੇ ΔCt-αS ਰੂਪਾਂ (Δ101-140) ਨੂੰ E. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡਾਈਸਲਫਾਈਡ ਬਾਂਡ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ αS ਸਿਸਟੀਨ ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਦੇ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਦੇ ਸਾਰੇ ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ 5 ਐਮਐਮ ਡੀਟੀਟੀ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।Tau441 isoform (Adgene #16316 ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ), ΔNt-Tau ਰੂਪ (Δ1–150, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲ IVA ਕਲੋਨਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀਟੀਟੀਟੀਟੀਏਏਜੀਏਏਜੀਏਜੀਏਜੀਏਟੀਏਸੀਏਟੀਜੀਟੀਜੀਸੀਸੀਏਸੀਸੀਜੀਸੀਜੀ, ਸੀਏਟੀਏਟੀਜੀਟੀਏਟੀਸੀਸੀਸੀਸੀਜੀਸੀਜੀ, ਸੀਏਟੀਏਟੀਜੀਟੀਏਟੀਸੀਸੀਸੀਟੀਸੀਟੀਟੀਸੀਟੀਸੀਟੀਟੀਸੀਟੀਟੀਸੀਟੀਸੀਟੀਸੀਟੀਟੀਸੀਟੀਟੀਏਏਏਜੀਟੀਏਟੀਏਐਂਟ 53) ਅਤੇ ΔTAAGTTAA53-variant- GGCTC5 ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨਾਲ) ਈ. ਕੋਲੀ ਕਲਚਰ ਸਨ 37°C ਅਤੇ 180 rpm 'ਤੇ OD600 = 0.6–0.7 ਤੱਕ ਵਧਿਆ, ਅਤੇ ਸਮੀਕਰਨ IPTG ਨਾਲ 37°C 'ਤੇ 3 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।4 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ 11,500 xg ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕਟਾਈ ਕਰੋ ਅਤੇ 150 mM NaCl ਵਾਲੇ ਖਾਰੇ ਬਫਰ ਨਾਲ ਧੋਵੋ।ਲੀਸਿਸ ਬਫਰ (20 ਮਿ.ਲੀ. ਪ੍ਰਤੀ 1 ਐਲ ਐਲ.ਬੀ.: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine, 50 μ0ptinM) ਵਿੱਚ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਮੁੜ ਲਾਗੂ ਕਰੋ।ਸੋਨਿਕੇਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ 10 ਦਾਲਾਂ ਲਈ 80% ਦੇ ਐਪਲੀਟਿਊਡ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (1 ਮਿੰਟ ਚਾਲੂ, 1 ਮਿੰਟ ਬੰਦ)।ਇੱਕ ਅਲਟਰਾਸਾਊਂਡ ਵਿੱਚ 60 ਮਿ.ਲੀ. ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਾ ਕਰੋ।ਈ. ਕੋਲਾਈ ਲਾਈਸੈਟਸ ਨੂੰ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 95° C 'ਤੇ ਗਰਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਠੰਢਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 40 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 127,000×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਸਪਸ਼ਟੀਕ੍ਰਿਤ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 3.5 kDa ਝਿੱਲੀ (ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ™ ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂ.ਕੇ.) 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 4 L ਡਾਇਲਸਿਸ ਬਫਰ (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgMCl2 m2 m2 m2) ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਡਾਇਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। , PMSF 0.1 mM) 10 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ.ਇੱਕ 5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਕੈਸ਼ਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਕਾਲਮ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ਨੂੰ ਸੰਤੁਲਨ ਬਫਰ (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PFMS) ਨਾਲ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।Tau lysate ਨੂੰ ਇੱਕ 0.22 μm PVDF ਫਿਲਟਰ ਦੁਆਰਾ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 1 ml/min ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 'ਤੇ ਕਾਲਮ ਵਿੱਚ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਲੂਸ਼ਨ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਊ ਨੂੰ 15-30% ਇਲਿਊਸ਼ਨ ਬਫਰ (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ਨਾਲ ਇਲਿਊਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਭਿੰਨਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਟਾਊ ਦੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਬੈਂਡ ਵਾਲੇ ਕਿਸੇ ਵੀ ਭਿੰਨਾਂ ਨੂੰ 10 kDa ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ਅਤੇ DTT m2 ਲਈ ਇੱਕ ਬਫਰ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਅੰਤਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 100 μM ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਘੋਲ ਨੂੰ ਫਿਰ ਇੱਕ 0.22 μm PVDF ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਾਇਆ ਗਿਆ, ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ K18 ਪ੍ਰੋ. ਅਲਬਰਟੋ ਬੋਫੀ ਦੁਆਰਾ ਦਿਆਲਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।SDS-PAGE ਅਤੇ MALDI-TOF/TOF ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਤਿਆਰੀ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ >95% ਸੀ।ਵੱਖ-ਵੱਖ cysteines ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ਜਾਂ TEMPOL-maleimide (ਟੋਰਾਂਟੋ ਰਿਸਰਚ ਕੈਮੀਕਲਜ਼, ਟੋਰਾਂਟੋ, ਕੈਨੇਡਾ) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸ਼ੋਸ਼ਣ ਅਤੇ ਮਾਲਡੀ-ਟੌਫ/ਟੋਫ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ਅਤੇ K18 ਨੂੰ ਉਸੇ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 191 ਅਤੇ 322 ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਮੂਲ ਸਿਸਟੀਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।αS ਅਤੇ Tau441 ਲਈ ਸ਼ੁੱਧ ਚਾਰਜ ਪ੍ਰਤੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨਕਸ਼ੇ CIDER66 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਠੋਸ ਪੌਲੀ-ਐਲ-ਲਾਈਸਾਈਨ (ਪੂਰਤੀਕਰਤਾ ਤੋਂ NMR ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ਨੂੰ 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ਤੋਂ 10 mM ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ sonicated ਇੱਕ ਅਲਟਰਾਸੋਨਿਕ ਪਾਣੀ ਦੇ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ ਮਿੰਟ ਅਤੇ -20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕਰੋ।PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ਅਤੇ FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹਨ ਅਤੇ LLPS ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੰਡੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਡਾਇਲਸਿਸ ਦੂਸ਼ਿਤ ਲੂਣ ਨੂੰ ਹਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ 0.22 μm ਦੇ ਪੋਰ ਆਕਾਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਰਿੰਜ ਫਿਲਟਰ ਦੁਆਰਾ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਇੱਕ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟੋਮੀਟਰ (ਮੈਟਲਰ ਟੋਲੇਡੋ, ਕੋਲੰਬਸ, ਓਹੀਓ, ਯੂਐਸਏ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।LLPS ਨਮੂਨੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ: ਬਫਰ ਅਤੇ ਐਕਸਟਰੂਜ਼ਨ ਨੂੰ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 1 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ (2-ਕਾਰਬੋਕਾਈਥਾਈਲ) ਫਾਸਫਾਈਨ (ਟੀਸੀਈਪੀ, ਕਾਰਬੋਸਿੰਥ, ਕੰਪਟਨ, ਯੂਕੇ), 1 ਐਮਐਮ 2,2,2,2- (ਈਥੇਨ- 1, 2-ਡਾਇਲਡਿਨਿਟ੍ਰੀਲ) ਟੈਟਰਾਸੇਟਿਕ ਐਸਿਡ (ਈਡੀਟੀਏ, ​​ਕਾਰਬੋਕਸਿੰਥ) ਅਤੇ 1% ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ (ਪੀਐਮਐਸਐਫ 100 ਐਮਐਮ, ਬੈਂਜੀਮਾਈਡ 1 ਐਮਐਮ, ਲੇਉਪੇਪਟਿਨ 5 μM) ਦਾ ਮਿਸ਼ਰਣ।ਫਿਰ αS ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਡ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨ (ਵਿਕਲਪ pLK ਜਾਂ Tau) ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਥਿਓਫਲੇਵਿਨ-ਟੀ ਟਾਈਮ ਸੀਰੀਜ਼ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ (ThT, Carbosynth, Compton, UK) ਲਈ, ਕੁੱਲ ThT ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅੱਧੀ αS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਰੋ।ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਨਰਮੀ ਨਾਲ ਪਰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਓ ਕਿ ਉਹ ਇਕੋ ਜਿਹੇ ਹਨ।ਹਰੇਕ ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਪ੍ਰਯੋਗ ਤੋਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਤੱਕ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਨਤੀਜੇ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਜ਼ੀਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 0.02% (w/v) ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਦੋਂ ਵੀ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਮਿਆਦ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।LLPS ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸਾਰੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਲਈ, ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ 5 ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਸੰਤੁਲਿਤ ਹੋਣ ਦਿਓ।ਲਾਈਟ ਸਕੈਟਰਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, 150 µl ਨਮੂਨੇ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ 96-ਵੈਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟਾਂ (µClear®, Black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ਉੱਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਚਿਪਕਣ ਵਾਲੀ ਫਿਲਮ ਨਾਲ ਢੱਕੇ ਹੋਏ ਸਨ।CLARIOstar ਪਲੇਟ ਰੀਡਰ (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) ਵਿੱਚ ਘੋਲ ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ 350 nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਨੂੰ ਮਾਪ ਕੇ LLPs ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ 25°C 'ਤੇ ਤਿਕੋਣੀ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਤਰੁੱਟੀਆਂ ਨੂੰ ਮੱਧਮਾਨ ਤੋਂ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਵਜੋਂ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਤਲੇ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਨਮੂਨਾ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਅਤੇ SDS-PAGE ਜੈੱਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪਤਲੇ ਅਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ αS ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ LLPS ਹੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ 100 μl LLPS ਨਮੂਨਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1 μM AF488-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ αS ਹੈ, ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਕਸਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 9600×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਸੀ।SDS-PAGE ਜੈੱਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦੇ ਸਿਖਰਲੇ 50 μl ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ.ਜੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ChemiDoc ਜੈੱਲ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸਿਸਟਮ (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼, ਹਰਕੂਲੀਸ, CA, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ AF488 ਫਿਲਟਰਾਂ ਨਾਲ ਸਕੈਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਾਂ Coomassie ਸਟੈਨ ਨਾਲ ਦਾਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉਚਿਤ ਫਿਲਟਰਾਂ ਨਾਲ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਤੀਜੇ ਵਾਲੇ ਬੈਂਡਾਂ ਦਾ ਇਮੇਜਜੇ ਸੰਸਕਰਣ 1.53i (ਨੈਸ਼ਨਲ ਇੰਸਟੀਚਿਊਟ ਆਫ਼ ਹੈਲਥ, ਯੂਐਸਏ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਡੁਪਲੀਕੇਟ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, 150 μl ਨਮੂਨੇ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ 96-ਵੈਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਇੱਕ Leica DMI6000B ਉਲਟ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਲੀਕਾ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ, ਵੇਟਜ਼ਲਰ, ਜਰਮਨੀ) 'ਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਪਾਟ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, µ-ਸਲਾਈਡ ਐਂਜੀਓਜੇਨੇਸਿਸ ਪਲੇਟਾਂ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ਜਾਂ 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ਵੀ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।EL6000 ਹੈਲੋਜਨ ਜਾਂ ਮਰਕਰੀ ਮੈਟਲ ਹੈਲਾਈਡ ਲੈਂਪ ਰੋਸ਼ਨੀ ਸਰੋਤਾਂ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ BF/DIC ਅਤੇ WF ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ)।WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਲਈ, ਨਮੂਨੇ 'ਤੇ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਫੋਕਸ ਕਰਨ ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਲਈ 40x ਵੱਡਦਰਸ਼ੀ ਹਵਾ ਉਦੇਸ਼ (ਲੀਕਾ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।AF488 ਅਤੇ ThT ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਮਿਆਰੀ GFP ਫਿਲਟਰ ਸੈੱਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਫਿਲਟਰ ਉਤੇਜਨਾ ਅਤੇ ਨਿਕਾਸ, ਉਤੇਜਨਾ ਅਤੇ ਐਮੀਸ਼ਨ ਬੈਂਡਪਾਸ ਫਿਲਟਰ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ, 460–500 nm ਅਤੇ 512–542 nm ਬੈਂਡਪਾਸ ਫਿਲਟਰ, ਅਤੇ ਇੱਕ 495 nm dichrod.Atto647N ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ 628–40 nm ਅਤੇ 692–40 nm, ਉਤਸ਼ਾਹ ਅਤੇ ਐਮੀਸ਼ਨ ਬੈਂਡਪਾਸ ਫਿਲਟਰਾਂ ਵਾਲੇ Cy5 ਫਿਲਟਰਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਸੈੱਟ, ਅਤੇ ਇੱਕ 660 nm ਡਾਇਕ੍ਰੋਇਕ ਸ਼ੀਸ਼ਾ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।BF ਅਤੇ DIC ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਲਈ, ਉਹੀ ਪ੍ਰਤੀਬਿੰਬਿਤ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਉਦੇਸ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।ਇਕੱਠੀ ਕੀਤੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਇੱਕ Leica DFC7000 CCD ਕੈਮਰੇ (Leica Microsystems, Germany) 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।BF ਅਤੇ DIC ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਸਮਾਂ 50 ms ਅਤੇ WF ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ 20-100 ms ਸੀ।ਤੁਲਨਾ ਲਈ, ThT ਦੇ ਨਾਲ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਐਕਸਪੋਜਰ ਸਮਾਂ 100 ms ਸੀ।ਬੂੰਦਾਂ ਦੇ ਸੰਯੋਗਤਾ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਟਾਈਮ-ਲੈਪਸ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਕਈ ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਹਰ 100 ms ਵਿੱਚ ਚਿੱਤਰ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਸਨ।ImageJ (NIH, USA) ਨੂੰ ਚਿੱਤਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ.ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਸਮਾਨ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਮੂਹੀਕਰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ, FRAP ਅਤੇ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ, ਚਿੱਤਰ ਇੱਕ ZEN 2 ਨੀਲੇ ਸੰਸਕਰਣ (ਕਾਰਲ ਜ਼ਾਈਸ ਏਜੀ, ਓਬਰਕੋਚੇਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ Zeiss LSM 880 ਇਨਵਰਟੇਡ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।50 μl ਦੇ ਨਮੂਨੇ µ-ਸਲਾਈਡ ਐਂਜੀਓਜੇਨੇਸਿਸ ਪੈਟਰੀ ਡਿਸ਼ਾਂ (Ibidi GmbH, Gröfelfing, ਜਰਮਨੀ) ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਪੌਲੀਮਰ (ibiTreat) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ 63× ਤੇਲ ਇਮਰਸ਼ਨ ਉਦੇਸ਼ (ਯੋਜਨਾ-ਅਪੋਕ੍ਰੋਮੈਟ 63.14/ਐਨਏ × 4) ਵਿੱਚ ਮਾਊਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। DIC 'ਤੇ)।ਚਿੱਤਰ 458 nm, 488 nm, ਅਤੇ 633 nm ਆਰਗਨ ਲੇਜ਼ਰ ਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 0.26 µm/ਪਿਕਸਲ ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨਾਲ ਅਤੇ 470–600 nm, 6283nm, 6283nm, 6283nm ਦੇ ਉਤੇਜਨਾ ਅਤੇ ਨਿਕਾਸੀ ਖੋਜ ਵਿੰਡੋਜ਼ ਲਈ 8 µs/ਪਿਕਸਲ ਦੇ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਟਾਈਮ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਅਤੇ 638–755 nm ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ThT, AF488 ਅਤੇ Atto647N ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।FRAP ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਟਾਈਮ-ਲੈਪਸ ਫੋਟੋਗ੍ਰਾਫੀ 1 ਫਰੇਮ ਪ੍ਰਤੀ ਸਕਿੰਟ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਾਰੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਦਾ ਜ਼ੇਨ 2 ਬਲੂ ਐਡੀਸ਼ਨ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਕਾਰਲ ਜ਼ੀਸ ਏਜੀ, ਓਬਰਕੋਚੇਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।FRAP ਵਕਰਾਂ ਨੂੰ ਓਰੀਜਿਨਪ੍ਰੋ 9.1 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜ਼ੇਨ 2 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਚਿੱਤਰਾਂ ਤੋਂ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕੀਤੇ ਤੀਬਰਤਾ/ਸਮੇਂ ਦੇ ਡੇਟਾ ਲਈ ਸਾਧਾਰਨ, ਪਲਾਟ ਅਤੇ ਫਿੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਬਲੀਚਿੰਗ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਘਾਤਕ ਮਿਆਦ ਦੇ ਨਾਲ ਅਣੂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਲਈ ਲੇਖਾ-ਜੋਖਾ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਕਵਰੀ ਕਰਵ ਇੱਕ ਮੋਨੋ-ਘਾਤਾਕਾਰੀ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਨਾਮਾਤਰ ਬਲੀਚਿੰਗ ਰੇਡੀਅਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ D ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਰਿਕਵਰੀ ਹਾਫ-ਲਾਈਫ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਕਾਂਗ ਐਟ ਅਲ ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿੱਚ ਹੈ।5 35 ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
αS ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਸਿਸਟੀਨ ਵੇਰੀਐਂਟਸ ਨੂੰ 24 (TEMPOL-24-αS) ਅਤੇ 122 (TEMPOL-122-αS) ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ 4-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸੀ-2,2,6,6-ਟੈਟਰਾਮੇਥਾਈਲਪਾਈਪੀਰੀਡੀਨ-ਐਨ-ਆਕਸੀਲ (TEMPOL) ਨਾਲ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ.ਸਪਿਨ ਲੇਬਲਿੰਗ EPR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, αS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 100 μM ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ PEG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 15% (w/v) ਸੀ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਏਕੀਕਰਣ ਸਥਿਤੀਆਂ ਲਈ, αS:pLK ਅਨੁਪਾਤ 1:10 ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ αS:ΔNt-Tau ਅਤੇ αS:Tau441 ਅਨੁਪਾਤ 1:1 'ਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਭੀੜ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਟਾਈਟਰੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਲਈ, TEMPOL-122-αS ਨੂੰ 50 μM ਤੇ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਵਧਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਟਾਈਟਰੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।CW-EPR ਮਾਪ ਇੱਕ Bruker ELEXSYS E580 X-ਬੈਂਡ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜੋ ਇੱਕ Bruker ER4118 SPT-N1 ਰੈਜ਼ੋਨੇਟਰ ਨਾਲ ਲੈਸ ਹੈ ਜੋ ~ 9.7 GHz ਦੀ ਮਾਈਕ੍ਰੋਵੇਵ (SHF) ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਤਾਪਮਾਨ 25°C 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਕ੍ਰਾਇਓਸਟੈਟ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ 4 mW ਦੀ ਇੱਕ MW ਪਾਵਰ, 0.1 mT ਦੇ ਇੱਕ ਮਾਡੂਲੇਸ਼ਨ ਐਪਲੀਟਿਊਡ, ਅਤੇ 100 kHz ਦੀ ਇੱਕ ਮਾਡੂਲੇਸ਼ਨ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਅਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।Tau441 ਜਾਂ ΔNt-Tau (ਅਸਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ) ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਬਕਾਇਆ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਕਾਰਨ ਨਮੂਨਿਆਂ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਸਪਿੱਨ ਕਟੌਤੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਪਿੱਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।g ਦੇ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਮੁੱਲ Matlab®67 ਵਿੱਚ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ Easyspin ਸੌਫਟਵੇਅਰ (v. 6.0.0-dev.34) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ EPR ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਮਾਡਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ/ਦੋ ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਆਈਸੋਟ੍ਰੋਪਿਕ ਮਾਡਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸਾਰੇ ਸਿਗਨਲਾਂ ਨੂੰ ਸਧਾਰਣ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਨੁਸਾਰੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਤੋਂ ਹਰੇਕ ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਬਾਈਡਿੰਗ ਟਾਈਟਰੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਤੀਜੇ ਬੈਂਡ ਦੀ ਸਾਧਾਰਨ ਈਪੀਆਰ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ (IIII/III) ਦੇ ਦੂਜੇ ਬੈਂਡ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ αS ਨਾਲ ਪੌਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਿਭਾਜਨ ਸਥਿਰਤਾ (Kd) ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਕਰ ਨੂੰ n ਸਮਾਨ ਅਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਮੰਨਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
NMR ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਪ੍ਰਯੋਗ ਇੱਕ ਬ੍ਰੂਕਰ ਨਿਓ 800 MHz (1H) NMR ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜੋ ਇੱਕ ਕ੍ਰਾਇਓਪਰੋਬ ਅਤੇ Z-ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਲੈਸ ਸਨ।ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗ 130–207 µM αS ਅਤੇ 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ਵਿੱਚ 130-207 µM αS ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ αS/ΔNt-Tau ਅਤੇ pLK ਸਮਾਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ 15°C 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।NMR ਦੁਆਰਾ LPS ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਨ ਲਈ, ਪ੍ਰੀ-ਮਿਕਸਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ 10% PEG ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟ ਪਰਟਰਬੇਸ਼ਨ ਪਲਾਟ (ਚਿੱਤਰ 1b) ਔਸਤ 1H ਅਤੇ 15N ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।αS 2D1H-15N HSQC ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਪਿਛਲੀ ਅਸਾਈਨਮੈਂਟ (BMRB ਐਂਟਰੀ #25227) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ HNCA, HNCO ਅਤੇ CBCAcoNH ਦੇ 3D ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਕੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।13Cα ਅਤੇ 13Cβ ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ΔNt-Tau ਜਾਂ pLK ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਤਾਂ ਕਿ ਸ਼ੁੱਧ ਬੇਤਰਤੀਬ ਕੋਇਲ ਕਨਫਰਮੇਸ਼ਨ 68 (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 5c) ਵਿੱਚ αS ਰਸਾਇਣਕ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੇ ਰੁਝਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵਿਤ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।R1ρ ਦਰਾਂ ਨੂੰ 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ਅਤੇ 800 ms ਦੀ ਦੇਰੀ ਨਾਲ hsqctretf3gpsi ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ (ਬ੍ਰੁਕਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ) ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਘਾਤਕ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟੀਚਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੇਰੀ ਦੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। R1ρ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਅਨਿਸ਼ਚਿਤਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸਮਾਂ।
ਦੋ-ਰੰਗਾਂ ਦੇ ਸਮੇਂ-ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਪ੍ਰਯੋਗ ਇੱਕ ਵਪਾਰਕ ਸਮਾਂ-ਹੱਲ ਕੀਤੇ MT200 ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਪੀਕੋਕੁਆਂਟ, ਬਰਲਿਨ, ਜਰਮਨੀ) 'ਤੇ ਇੱਕ ਸਮੇਂ-ਸਬੰਧਿਤ ਸਿੰਗਲ ਫੋਟੋਨ ਕਾਉਂਟਿੰਗ (TCSPC) ਯੰਤਰ ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਲੇਜ਼ਰ ਡਾਇਓਡ ਹੈੱਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪਲਸਡ ਇੰਟਰਲੀਵੇਡ ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ (ਪੀਆਈਈ) ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਬੀਮ ਸਿੰਗਲ ਮੋਡ ਵੇਵਗਾਈਡ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਦੀ ਹੈ ਅਤੇ 481 ਐੱਨਐੱਮ ਅਤੇ 637 ਐੱਨਐੱਮ ਲੇਜ਼ਰ ਲਾਈਨਾਂ ਲਈ 10 ਤੋਂ 100 nW ਦੀ ਲੇਜ਼ਰ ਪਾਵਰ ਨਾਲ ਟਿਊਨ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਡਾਇਕ੍ਰੋਇਕ ਸ਼ੀਸ਼ੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਾਪੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਹ ਫੋਟੌਨ ਅਲਾਈਸਿੰਗ, ਫੋਟੋਬਲੀਚਿੰਗ ਅਤੇ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਤੋਂ ਬਚ ਕੇ, ਇੱਕ ਅਨੁਕੂਲ ਫੋਟੋਨ ਗਿਣਤੀ ਦਰ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।μ-ਸਲਾਈਡ ਐਂਜੀਓਜੇਨੇਸਿਸ ਕਵਰਲਿਪਸ ਜਾਂ ਪਲੇਟਾਂ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ਜਰਮਨੀ) ਨੂੰ ਇੱਕ ਸੁਧਾਰਾਤਮਕ ਕਾਲਰ (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸੁਪਰ ਐਪੋਕ੍ਰੋਮੈਟ 60x NA 1.2 ਲੈਂਜ਼ ਉੱਤੇ ਡੁੱਬਣ ਵਾਲੇ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧਾ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ 488/640 nm ਡਾਇਕ੍ਰੋਇਕ ਸ਼ੀਸ਼ਾ (ਸੇਮਰੋਕ, ਲੇਕ ਫੋਰੈਸਟ, IL, USA) ਨੂੰ ਮੁੱਖ ਬੀਮ ਸਪਲਿਟਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫੋਕਸਡ ਰੇਡੀਏਸ਼ਨ ਨੂੰ 50 ਮਾਈਕਰੋਨ ਦੇ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਮੋਰੀ ਦੁਆਰਾ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਫਿਰ ਫੋਕਸਡ ਰੇਡੀਏਸ਼ਨ ਨੂੰ 50/50 ਬੀਮ ਸਪਲਿਟਰ ਦੁਆਰਾ 2 ਖੋਜ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਬੈਂਡਪਾਸ ਐਮੀਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ (ਸੇਮਰੌਕ, ਲੇਕ ਫੋਰੈਸਟ, IL, USA) ਹਰੇ ਰੰਗ ਲਈ 520/35 (AF488) ਅਤੇ 690/70 ਲਾਲ ਡਾਈ (Atto647N) ਲਈ ਡਿਟੈਕਟਰ ਦੇ ਸਾਹਮਣੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਿੰਗਲ-ਫੋਟੋਨ ਐਵਲੈਂਚ ਡਾਇਡਸ (SPAD) (ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਫੋਟੌਨ ਡਿਵਾਈਸ, ਬੋਲਜ਼ਾਨੋ, ਇਟਲੀ) ਨੂੰ ਡਿਟੈਕਟਰਾਂ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਪਾਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ SymphoTime64 ਸੌਫਟਵੇਅਰ (PicoQuant GmbH, ਬਰਲਿਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡਾਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੋਵੇਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਐਲਐਲਪੀਐਸ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਪੰਜਾਹ ਮਾਈਕ੍ਰੋਲਿਟਰ μ-ਸਲਾਈਡ ਐਂਜੀਓਜੇਨੇਸਿਸ ਖੂਹਾਂ (ਇਬੀਡੀ ਜੀਐਮਬੀਐਚ, ਗ੍ਰੈਫੇਲਫਿੰਗ, ਜਰਮਨੀ) ਤੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ ਲਈ ਸਰਵੋਤਮ ਉਦੇਸ਼ ਕੰਮ ਕਰਨ ਦੀ ਦੂਰੀ ਲਈ ਖੂਹ ਦੇ ਹੇਠਾਂ 20 µm ਉੱਤੇ ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 0.25 µm/ਪਿਕਸਲ ਦੇ ਧੁਰੀ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਅਤੇ 400 µs/ਪਿਕਸਲ ਦੇ ਦੇਰੀ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਰਾਫਟਾਂ ਅਤੇ ਬਿੰਦੀਆਂ ਲਈ ~1 µm ਤੱਕ ਫੋਕਸ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਚੈਨਲ ਲਈ ਔਸਤ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਸਿਗਨਲ ਤੀਬਰਤਾ (PBG, ਮਤਲਬ + 2σ) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਇੱਕ ਤੀਬਰਤਾ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ ਤਾਂ ਕਿ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਪੜਾਅ ਤੋਂ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸੰਭਾਵਿਤ ਮੂਲ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਸਿਰਫ ਤਰਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਬੂੰਦਾਂ, ਰਾਫਟ ਜਾਂ ਚਟਾਕ ਚੁਣੇ ਜਾਣ।ਹਰੇਕ ਚੈਨਲ ਦੀ ਹਰੇਕ ਸਪੀਸੀਜ਼ (τ) ਦੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ (ਹਰੇ, AF488 ਲਈ "g" ਅਤੇ ਲਾਲ, Atto647N ਲਈ "r"), ਅਸੀਂ ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ (ROIs) ਨੂੰ ਚੁਣਿਆ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਬੂੰਦਾਂ, ਰਾਫਟ ਜਾਂ ਚਟਾਕ (ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1) ).8b) ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪੂਛ-ਫਿੱਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਇੱਕ ਦੋ-ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਸੜਨ ਵਾਲੇ ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹਰੇਕ ਚੈਨਲ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਜੀਵਨ ਭਰ ਦੇ ਸੜਨ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਬੂੰਦਾਂ, ਰਾਫਟਾਂ ਜਾਂ ਚਟਾਕਾਂ ਲਈ τD, τR ਅਤੇ τP, ਕ੍ਰਮਵਾਰ, ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਚਿੱਤਰ 8c ਦੇਖੋ) ਫਿੱਟ ਕਰਕੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਲਿਆ ਗਿਆ।ਔਸਤ τ ਤੋਂ τ।ROI ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ ਬਹੁ-ਘਾਤਕ ਫਿੱਟ ਲਈ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਫੋਟੌਨ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਸਨ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਰਤੇ ਗਏ ਕੱਟਆਫ ਰੇਫਟਾਂ ਅਤੇ ਬਿੰਦੀਆਂ ਲਈ <104 ਫੋਟੌਨ ਅਤੇ ਬੂੰਦਾਂ ਲਈ 103 ਸਨ।ਬੂੰਦਾਂ ਦੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਉੱਚ ਤੀਬਰਤਾ ਵਾਲੇ ਮੁੱਲਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਸੜਨ ਵਾਲੇ ਵਕਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਚਿੱਤਰ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਬੂੰਦਾਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਛੋਟੀਆਂ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਫੋਟੋਨ ਸੰਚਵ ਸੀਮਾ (>500 ਗਿਣਤੀਆਂ/ਪਿਕਸਲ 'ਤੇ ਸੈੱਟ) ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਫੋਟੋਨ ਗਿਣਤੀ ਵਾਲੇ ROI ਨੂੰ ਵੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਰਵਿਸ ਲਾਈਫ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਤੋਂ ਲੈ ਕੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ 90% (ਸੜਨ ਦੀ ਅਧਿਕਤਮ ਤੀਬਰਤਾ ਤੋਂ ਥੋੜ੍ਹਾ ਬਾਅਦ) ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਸੜਨ ਵਾਲੇ ਵਕਰ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ IRF ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮਿਲਾਓ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਸੜਨ ਲਈ ਉਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਣਾਈ ਰੱਖੋ। ਸੈਟਿੰਗਾਂ ਸਾਪੇਖਿਕ ਸਮਾਂ ਵਿੰਡੋ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ 25 ਤੋਂ 50 ROI ਰਾਫਟਸ ਅਤੇ ਸਪੌਟਸ ਲਈ ਅਤੇ 15-25 ROI ਬੂੰਦਾਂ ਲਈ, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ 4 ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ।ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਟੀ-ਟੈਸਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਜਾਂ ਕੋਸਰਵੇਟ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਕੜਾ ਅੰਤਰਾਂ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਲਾਈਫਟਾਈਮ (τ) ਦੇ ਪਿਕਸਲ-ਬਾਈ-ਪਿਕਸਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਹਰੇਕ ਚੈਨਲ ਲਈ ਫੀਲਡ ਉੱਤੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਦੇ ਕੁੱਲ ਅਟੈਨਯੂਏਸ਼ਨ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ 2/3-ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਐਕਸਪੋਨੈਂਸ਼ੀਅਲ ਐਟੀਨਯੂਏਸ਼ਨ ਮਾਡਲ ਦਾ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਪਿਕਸਲ ਲਈ ਲਾਈਫਟਾਈਮ ਐਟੀਨਯੂਏਸ਼ਨ ਫਿਰ ਪਹਿਲਾਂ ਗਣਿਤ ਕੀਤੇ τ ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਫਿੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ ਸੂਡੋਕਲਰ FLIM ਫਿੱਟ ਚਿੱਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਟੇਲ-ਫਿੱਟ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਦੀ ਰੇਂਜ ਇੱਕੋ ਚੈਨਲ ਦੇ ਸਾਰੇ ਚਿੱਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਸੀ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਸੜਨ ਨੇ ਇੱਕ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਫਿਟ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਫੋਟੌਨ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਸਨ।FRET ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, 100 ਫੋਟੌਨਾਂ ਦੀ ਘੱਟ ਤੀਬਰਤਾ ਵਾਲੇ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਕੇ ਪਿਕਸਲ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਕਿ 11 ਫੋਟੌਨਾਂ ਦੇ ਬੈਕਗਰਾਊਂਡ ਸਿਗਨਲ (FBG) ਦਾ ਔਸਤਨ ਸੀ।ਹਰੇਕ ਚੈਨਲ ਦੀ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਿਤ ਸੁਧਾਰ ਕਾਰਕਾਂ ਦੁਆਰਾ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: 69 ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਕ੍ਰਾਸਸਟਾਲ α 0.004 ਸੀ, ਸਿੱਧਾ ਉਤਸ਼ਾਹ β 0.0305 ਸੀ, ਖੋਜ ਕੁਸ਼ਲਤਾ γ 0.517 ਸੀ।ਪਿਕਸਲ ਪੱਧਰ 'ਤੇ FRET ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਫਿਰ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਸਮੀਕਰਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਿਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ:
ਜਿੱਥੇ FDD ਡੋਨਰ (ਹਰੇ) ਚੈਨਲ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਹੈ, FDA ਅਸਿੱਧੇ ਉਤੇਜਨਾ ਅਧੀਨ ਸਵੀਕਾਰਕਰਤਾ (ਲਾਲ) ਚੈਨਲ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ FAA ਪ੍ਰਤੱਖ ਉਤੇਜਨਾ (ਲਾਲ) ਚੈਨਲ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੱਖ ਉਤੇਜਨਾ ਅਧੀਨ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਹੈ। PIE).ਚੈਨਲ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਦਾਲਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ)।
LLPS ਬਫਰ (ਉਪਰੋਕਤ ਅਨੁਸਾਰ ਪੂਰਕ) ਵਿੱਚ 25 µM ਅਨਲੇਬਲਡ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ Tau441 (25 µM αS ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ) ਵਾਲੇ LLPS ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਹੱਲਾਂ ਦੇ 100 µl ਨੂੰ ਅਡੈਸਿਵ ਫੋਇਲ ਕੋਟਿੰਗ ਵਾਲੇ ਗੈਰ-ਬਾਈਡਿੰਗ 96-ਵੈਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟਾਂ 'ਤੇ ਰੱਖੋ ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਦੁਆਰਾ ਡਬਲਯੂਐਫ ਫਾਰਮ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੰਤੁਲਨ10 ਮਿੰਟ ਦੇ ਅੰਦਰ.ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰਾਫਟ ਅਤੇ ਚਟਾਕ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਫਿਰ ਸਾਵਧਾਨੀ ਨਾਲ ਖੂਹਾਂ ਤੋਂ ਰਾਫਟਾਂ ਦੇ ਉੱਪਰ ਤਰਲ ਨੂੰ ਹਟਾਓ, ਫਿਰ 50 L ਡਿਸਸੋਸਿਏਸ਼ਨ ਬਫਰ (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ਪਾਓ ਅਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।ਉੱਚ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ LLPS ਬਕਾਇਆ ਪੀਈਜੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਦੁਹਰਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਕੇਵਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸੰਭਾਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਸੈਂਬਲੀਆਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।ਫਿਰ ਖੂਹ ਦੇ ਤਲ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਿਪੇਟ ਟਿਪ ਨਾਲ ਖੁਰਚਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਘੋਲ ਨੂੰ ਇੱਕ ਖਾਲੀ ਨਿਰੀਖਣ ਖੂਹ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।1 ਘੰਟੇ ਲਈ 50 μM ThT ਦੇ ਨਾਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਡਬਲਯੂਐਫ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਚਟਾਕਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 70-µM αS ਘੋਲ ਦੇ 300 µl pH 7.4, ਸੋਡੀਅਮ ਅਜ਼ਾਈਡ 0.01% ਨੂੰ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਅਤੇ 200 rpm ਨੂੰ 7 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਔਰਬਿਟਲ ਸ਼ੇਕਰ 'ਤੇ ਪਾ ਕੇ ਸੋਨਿਕੇਟਿਡ αS ਫਾਈਬਰਿਲ ਤਿਆਰ ਕਰੋ।ਘੋਲ ਨੂੰ ਫਿਰ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ 9600×g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਗੋਲੀ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ pH 7.4 ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੋਨਿਕੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (1 ਮਿੰਟ, 50% ਚੱਕਰ, ਵਾਈਬਰਾ-ਸੈੱਲ VC130 ਸੋਨੀਕੇਟਰ, ਸੋਨਿਕਸ, ਨਿਊਟਨ, ਯੂਐਸਏ ਵਿੱਚ 80% ਐਪਲੀਟਿਊਡ, ਸੋਨਿਕਸ, ਨਿਊਟਨ, ਯੂਐਸਏ) ਫਾਈਬਰਿਲ ਸੈਂਪਲ ਛੋਟੇ ਫਾਈਬਰਲਾਂ ਦੀ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਇਕਸਾਰ ਆਕਾਰ ਦੀ ਵੰਡ ਦੇ ਨਾਲ।
FCS/FCCS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਦੋ-ਰੰਗ ਸੰਜੋਗ ਖੋਜ (TCCD) PIE ਮੋਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ FLIM-FRET ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਉਸੇ MT200 ਸਮੇਂ-ਸੁਲਝੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਪੀਕੋ-ਕਵਾਂਟ, ਬਰਲਿਨ, ਜਰਮਨੀ) 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਲੇਜ਼ਰ ਪਾਵਰ ਨੂੰ 6.0 µW (481 nm) ਅਤੇ 6.2 µW (637 nm) ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹਨਾਂ ਲੇਜ਼ਰ ਸ਼ਕਤੀਆਂ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਗਿਣਤੀ ਦਰਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਫੋਟੋਬਲੀਚਿੰਗ ਅਤੇ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤਾ ਤੋਂ ਬਚਣ ਦੌਰਾਨ ਵਰਤੇ ਗਏ ਫਲੋਰੋਫੋਰਸ ਦੇ ਜੋੜਿਆਂ ਲਈ ਸਮਾਨ ਚਮਕ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਪਾਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ SymphoTime64 ਸੰਸਕਰਣ 2.3 ਸਾਫਟਵੇਅਰ (PicoQuant, ਬਰਲਿਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡਾਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੋਵੇਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
LLPS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਆਈਸੋਲੇਟਡ αS/Tau ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਢੁਕਵੀਂ ਮੋਨੋਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 1:500 ਪਤਲਾ ਹੋਣਾ, ਕਿਉਂਕਿ ਐਗਰੀਗੇਟਸ ਪਹਿਲਾਂ ਹੀ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਕੋਸਰਵੇਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ)।ਨਮੂਨੇ 1 mg/mL ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ BSA ਘੋਲ ਨਾਲ ਪ੍ਰੀਕੋਏਟਿਡ ਕਵਰਲਿਪਸ (ਕੋਰਨਿੰਗ, ਯੂਐਸਏ) 'ਤੇ ਸਿੱਧੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਹਰੇ ਅਤੇ ਲਾਲ ਚੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ PIE-smFRET ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਘੱਟ ਤੀਬਰਤਾ ਵਾਲੇ ਸਿਗਨਲਾਂ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ ਕਰਨ ਲਈ 25 ਫੋਟੌਨਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਘੱਟ ਤੀਬਰਤਾ ਦੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਨੋਟ ਕਰੋ ਕਿ ਮੋਨੋਮਰਸ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਸਮੁੱਚਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਇਕੱਤਰ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹਨ)।ਇਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦੀ ਗਣਨਾ ਸ਼ੁੱਧ ਮੋਨੋਮਰ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੋਨੋਮੇਰਿਕ αS ਦੀ ਔਸਤ ਤੀਬਰਤਾ ਤੋਂ ਪੰਜ ਗੁਣਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਮੂਹਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ।ਪੀਆਈਈ ਡਰਾਈਵ ਸਰਕਟ, ਟੀਐਸਸੀਪੀਸੀ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਦੇ ਨਾਲ, ਨੇ ਇੱਕ ਜੀਵਨ ਭਰ ਭਾਰ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਸਮਰੱਥ ਬਣਾਇਆ ਹੈ ਜੋ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਅਤੇ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਕ੍ਰਾਸਸਟਾਲ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਉਪਰੋਕਤ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਚੁਣੀ ਗਈ ਭੜਕਣ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਸਿਰਫ-ਬਫਰ-ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ/ਬਿਨ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਔਸਤ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਵੱਡੇ ਸਮੂਹਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਬਰਸਟ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟਾਈਮ ਟਰੇਸ (1 ms 'ਤੇ ਸੈੱਟ) ਵਿੱਚ ਲਗਾਤਾਰ ਕਈ ਬਿੰਨਾਂ 'ਤੇ ਕਬਜ਼ਾ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਤਾਕਤ ਦਾ ਇੱਕ ਡੱਬਾ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।FRET ਅਤੇ stoichiometric ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਗਾਮਾ ਫੈਕਟਰ γ (0.517) ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਰਤੇ ਗਏ ਉਤੇਜਨਾ ਲੇਜ਼ਰ ਪਾਵਰ 'ਤੇ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਕ੍ਰਾਸਸਟਾਲ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੱਖ ਉਤੇਜਨਾ ਯੋਗਦਾਨ ਨਾਂਹ ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਹਨ (ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਿਤ)।ਇੱਕ ਵਿਸਫੋਟ ਵਿੱਚ FRET ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟਰੀ ਦੀ ਗਣਨਾ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।