347 ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਕੋਇਲਡ ਟਿਊਬਿੰਗ ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪੋਨੈਂਟ, ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (CLMS) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨਾਵਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਜਵਾਬਦੇਹ ਮਨੁੱਖੀ ਲਿਊਕੋਸਾਈਟ ਐਂਟੀਜੇਨ-ਏ (HLA-A) ਚੈਪਰੋਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ

Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ।ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਮਰਥਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਮਰਥਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸਾਈਟ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਪ੍ਰਤੀ ਸਲਾਈਡ ਤਿੰਨ ਲੇਖ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਸਲਾਈਡਰ।ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਪਿੱਛੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਹਰ ਇੱਕ ਸਲਾਈਡ ਵਿੱਚ ਜਾਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡ ਕੰਟਰੋਲਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।

ਉਤਪਾਦ ਵਰਣਨ

ਸਟੀਲ 347L ਕੋਇਲ ਟਿਊਬ, ਸਟੀਲ ਗ੍ਰੇਡ: SS347L

ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਸਿਸਟਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਤੋਂ ਪੈਥੋਜਨਿਕ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਰੋਗ ਸੰਬੰਧੀ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਲਈ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਾਈਟੋਕਾਈਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇਨਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸਬਸੈੱਟ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਨਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ DSS-ਵਿਚੋਲੇ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੈਟਰੀ (CLMS) ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ।ਸੰਭਾਵਿਤ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇੰਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇੰਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ MX1, USP18, OAS3, ਅਤੇ STAT1 ਦੇ ਨਾਵਲ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਅਤੇ ਇੰਟਰਾਮੋਲੀਕੂਲਰ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਐਡਕਟਾਂ ਦੀ ਵੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ HLA-A ਪ੍ਰੋਟੀਨ (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਏ ਗਏ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇਨਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੇ ਇੱਕ ਨਾਵਲ ਸੈੱਟ ਦੇ ਆਰਥੋਗੋਨਲ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜੋ ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅਤੇ ਅਣੂ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਗਲੇ ਅਧਿਐਨ 'ਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਮਾਡਲਿੰਗ ਨੇ ਕਈ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਜੋ CLMS ਖੋਜਾਂ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਕੱਠੇ ਮਿਲ ਕੇ, ਅਸੀਂ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਨਵੇਂ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ CLMS ਦਾ ਇੱਕ ਪਾਇਲਟ ਅਧਿਐਨ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਐਨਵਾਇਰਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਨਵੀਂ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ CLMS ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।
ਇੱਕ ਅਨੁਕੂਲ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਮੇਜ਼ਬਾਨ ਦੀ ਪੈਦਾਇਸ਼ੀ ਰੱਖਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਇੱਕ ਐਂਟੀਮਾਈਕਰੋਬਾਇਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਮਾਊਂਟ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜਿਸਨੂੰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ (IFNs) ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਕਿਸਮ I IFN ਕਲਾਸਾਂ IFNα ਅਤੇ IFNβ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ, ਪ੍ਰੋਪੋਪੋਟੋਟਿਕ, ਪ੍ਰੋਇਨਫਲਾਮੇਟਰੀ, ਅਤੇ ਐਂਟੀਪ੍ਰੋਲੀਫੇਰੇਟਿਵ ਰਾਜ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ, IFNα ਦੀਆਂ 13 ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ ਜਾਣੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਸਾਰੇ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ 91 'ਤੇ ਕਲੱਸਟਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, ਕਲੀਨਿਕਲ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਸਿਰਫ IFNα2 ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, IFNα ਦੀਆਂ ਹੋਰ ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ 'ਤੇ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ IFNα14 ਕੈਨੋਨੀਕਲ IFNα2 ਉਪ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ HBV2 ਅਤੇ HIV-13,4 ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਆਈਸੋਫਾਰਮਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਹੈ।
ਇਹ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਟਾਈਪ I ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਰੀਸੈਪਟਰ ਕੰਪਲੈਕਸ (IFNAR1 ਅਤੇ IFNAR2) ਜੈਨਸ ਕਿਨਾਸੇਸ TYK2 ਅਤੇ JAK15,6 ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੇ ਸਿਗਨਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਕੈਸਕੇਡ ਨੂੰ ਟਰਿੱਗਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਜੈਨਸ ਕਿਨਾਸ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟ ਸਿਗਨਲ ਟਰਾਂਸਡਿਊਸਰ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਐਕਟੀਵੇਟਰਸ (STAT1 ਅਤੇ STAT2) ਨੂੰ SH2 ਡੋਮੇਨ-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੇ heterodimerization6 ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਲਈ ਟਾਈਰੋਸਿਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 'ਤੇ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, IRF9 STAT heterodimers ਨੂੰ IFN-ਸਟਿਮੂਲੇਟਿਡ ਫੈਕਟਰ 3 ਜੀਨ (ISGF3) ਦਾ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਈਮੇਰਿਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਬਦਲਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 2000 ਤੋਂ ਵੱਧ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਜੀਨਾਂ (ISGs, 5,6,7) ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ISGs ਕੁਦਰਤੀ ਇਮਿਊਨ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਵਾਇਰਲ ਹਮਲੇ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ।ਵਾਇਰਲ ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਬਚਾਅ ਦੀ ਪਹਿਲੀ ਲਾਈਨ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਜੈਵਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦੇ ਨਾਲ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵਿਆਪਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਤੈਨਾਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਟਰਨ ਮਾਨਤਾ ਸੰਵੇਦਕ, ਸੰਕੇਤਕ ਅਣੂ, ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਾਰਕ, ਅਤੇ ਸਿੱਧੇ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ISG ਗਤੀਵਿਧੀ 'ਤੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਜਾਣਕਾਰੀ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ ਸਕ੍ਰੀਨ 10,11 ਜਾਂ ਜੀਨ ਸਾਈਲੈਂਸਿੰਗ ਤਕਨੀਕਾਂ (siRNA, RNAi ਅਤੇ CRISPR) 12,13 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਸਕ੍ਰੀਨਾਂ ਤੋਂ ਆਉਂਦੀ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ISGs ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਜਾਂ ਰੋਕਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਵਾਇਰਸਾਂ 'ਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹਨਾਂ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ISGs ਦੀਆਂ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਪਰ ਹਰੇਕ ISG ਦੇ ਅੰਤਰੀਵ ਅਣੂ ਵਿਧੀਆਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਣਜਾਣ ਹਨ।ਇਹ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਵੀਕਾਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਜਾਂ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਾਈਟੋਕਾਈਨਜ਼ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਇਸਲਈ ਜਾਂ ਤਾਂ ISGs ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਵਿੱਚੋਲੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਫੋਟੋਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ATPase VCP/p97 ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰਮੁੱਖ IFITM3 ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਪਾਰਟਨਰ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ, ਜਿਸਦੀ ਰੋਕਥਾਮ 14 ਵਾਇਰਲ ਕਣਾਂ ਦੇ ਨਾਲ IFITM3 ਦੇ ਲਾਈਸੋਸੋਮਲ ਲੜੀਬੱਧ, ਟਰਨਓਵਰ, ਅਤੇ ਕੋਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿੱਚ ਨੁਕਸ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ VAPA, ਇੱਕ ਵੇਸਿਕਲ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਨੂੰ IFITM1/2/3 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਪਾਰਟਨਰ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਜੋ ਕੋਲੇਸਟ੍ਰੋਲ-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਇਰਲ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਖਮੀਰ ਦੋ-ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਦੁਆਰਾ ਇਸਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਵਿਗਿਆਨਕ ਸਹਾਇਤਾ 15 , 16 .
ਲਾਗ ਅਤੇ ਘਾਤਕ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੇ ਦਮਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਇੱਕ ਬੁਨਿਆਦੀ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਐਂਟੀਜੇਨ ਪ੍ਰਸਤੁਤੀ ਹੈ, ਜੋ ਮੁੱਖ ਹਿਸਟੋਕੰਪਟੀਬਿਲਟੀ ਕੰਪਲੈਕਸ (MHC) ਅਣੂਆਂ ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਕਲੀਵਡ, ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਬੰਦ ਜਾਂ ਗਲਤ ਫੋਲਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਪੈਪਟਾਇਡਸ (8-12 ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਲੰਬੇ) ਨੂੰ MHC-I ਹੈਟਰੋਡਾਈਮਰ (MHC-I ਭਾਰੀ ਅਤੇ ਹਲਕੀ ਚੇਨਾਂ, ਜਿਸਨੂੰ β-2-ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੋਬੂਲਿਨ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ; β2M) 17,18 ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸਥਿਰ MHC-I ਟ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਲਿਜਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਉਹ CD8+ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ (ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਕ ਟੀ ਸੈੱਲ) 17 ਨੂੰ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਟੀ ਸੈੱਲ ਇਹਨਾਂ ਜਰਾਸੀਮਾਂ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਟੀਜੇਨ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪਛਾਣਦੇ ਅਤੇ ਨਸ਼ਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਰੋਗਾਣੂ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਅਕਸਰ ਇਮਿਊਨ ਨਿਗਰਾਨੀ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਐਂਟੀਜੇਨ ਪ੍ਰਸਤੁਤੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਦਬਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਮਨੁੱਖੀ ਟਿਊਮਰਾਂ ਦੇ 40-90% ਵਿੱਚ MHC-I ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅਕਸਰ ਇੱਕ ਗਰੀਬ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਜਰਾਸੀਮ ਪ੍ਰਤੀ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਆਰਾਮ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਅਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਜਲਦੀ ਬਦਲਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਕਈ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ IFN ਮੰਗ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਕ੍ਰੋਮੈਟਿਨ 20,21 ਦੀ ਰੀਮਡਲਿੰਗ ਅਤੇ ਸੋਧ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ IFN ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ISG ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਮਾਡਲ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕਈ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੌਮਿਕ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਸੈਲੂਲਰ ਲੈਂਡਸਕੇਪ 'ਤੇ IFN ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਵੱਧ ਰਹੀ ਸਮਝ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਅਸੀਂ ਅਜੇ ਵੀ ISGs ਦੀ ਸ਼ਮੂਲੀਅਤ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਦੇ ਹਾਂ।ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਦੀ ਗੁੰਝਲਤਾ ਅਤੇ ਸਮਾਂ-ਨਿਰਭਰ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਦੋ ਸਵਾਲ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ: (i) ਕੀ ਤੇਜ਼ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਮਲਟੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਫਸਾਉਣਾ ਸੰਭਵ ਹੈ, ਅਤੇ (ii) ਕੀ ਇਹਨਾਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ 3D ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਮੈਪ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ?
ਇਹਨਾਂ ਮੁੱਦਿਆਂ ਨੂੰ ਸੰਬੋਧਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ IFNα-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਨੈਟਵਰਕ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੈਟਰੀ (CLMS) ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲ ਕੇ ਡਿਸਕਸਿਨਮਾਈਡ ਸਬਰੇਟ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਕੈਮੀਕਲ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ (DSS) ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ।DSS ਵੀਵੋ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਵਿਚਕਾਰ ਸਹਿ-ਸੰਚਾਲਕ ਬਾਂਡ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦਾ MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਖਾਸ ਕਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਕਿਸੇ ਖਾਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅੰਦਰ ਖੇਤਰਾਂ ਦੀ ਸਥਾਨਿਕ ਨੇੜਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਸਨੂੰ ਅੰਦਰੂਨੀ ਲਿੰਕੇਜ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਸਬਯੂਨਿਟ, ਜਿਸਨੂੰ ਆਪਸੀ ਸਬੰਧ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਪਹੁੰਚ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਕਈ ਨਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਮਲਟੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਨੈਟਵਰਕ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਨਵੀਆਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਸਬਸੈੱਟ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ H2BFS (H2B ਹਿਸਟੋਨ-ਕਿਸਮ FS; ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ H2B ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਅਤੇ MDN1 HLA-A ਲਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪਾਰਟਨਰ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲ esophageal adenocarcinoma ਦੇ ਵਿਟਰੋ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ esophageal ਟਿਊਮਰ 22,23 ਦੀਆਂ ਮੁੱਖ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਰੇ ਟਿਊਮਰ ਇਮਯੂਨੋਜਨਿਕ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਇਲਾਜ ਲਈ ਜਵਾਬ ਦਿੰਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 10 ng/ml IFNα ਨਾਲ Flo-1 ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ।ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਪੀ.ਐੱਸ.ਟੀ.ਏ.ਟੀ.1 ਅਤੇ ਆਈ.ਆਰ.ਐੱਫ.1 ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸ਼ਮੂਲੀਅਤ ਦਿਖਾਈ, ਇਲਾਜ ਤੋਂ 2 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਤੱਕ ਜਾਰੀ ਰਹਿੰਦੀ ਹੈ, IRF1 (ਚਿੱਤਰ 1A) ਦੇ ਸਥਿਰ ਪੱਧਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮੇਂ-ਨਿਰਭਰ ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ।ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, ਅਤੇ ISG15) ਨੂੰ IFNα (ਚਿੱਤਰ 1A) ਦੇ ਕਲਾਸਿਕ ਮੱਧ ਅਤੇ ਦੇਰ ਪੜਾਅ ਦੇ ਜਵਾਬਾਂ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, 6 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਕੱਠੇ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇਹ ਸੈਲੂਲਰ ਮਾਡਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
IFNα ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਭਿੰਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ।(ਏ) 2, 6, 24, 48 ਅਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 10 ng/ml IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਆਈਐਸਜੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।(ਬੀ) ਸੰਕੇਤ ਕੀਤੇ ਸਮੇਂ ਅਤੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ DSS ਨਾਲ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੂਰੇ ਸੈੱਲ ਦੇ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇ ਕੂਮੈਸੀ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਦੇ SDS-PAGE ਜੈੱਲ।(C) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਉਸੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ p53(DO-1) ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ।
ਇਨ-ਸੀਟੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਲੈਂਡਸਕੇਪ ਨੂੰ ਕੈਪਚਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ DSS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਇੱਕ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਏਜੰਟ ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਪਾਰਗਮਤਾ ਅਤੇ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮੇਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ।ਛੋਟਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਮਾਂ ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵੱਡੇ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਕਰਾਸਲਿੰਕਰ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਬਣਾਈ ਰੱਖੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਅਨੁਕੂਲ DSS ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਓਵਰ-ਕਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 5, 10, 5, ਅਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 5, 2.5, ਅਤੇ 1 mM DSS ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ Coomassie-stained SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਲਾਈਸੇਟਸ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ)।ਸੈੱਲ ਲਾਈਸੈਟਸ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਇਸਲਈ, DSS ਨੂੰ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 1, 0.5, ਅਤੇ 0.1 mM ਵਿੱਚ ਦਰਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 1B)।5 ਮਿੰਟ ਲਈ 0.5 mM DSS ਦੇ ਨਾਲ ਅਨੁਕੂਲ ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹ ਸਥਿਤੀਆਂ IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਚੁਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਚਿੱਤਰ 1C ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ p53 (DO-1) ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਪੱਛਮੀ ਧੱਬਾ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਰ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਇਲਾਜ 10 ng/ml IFNα ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਦੋ-ਪੜਾਅ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ FASP (ਚਿੱਤਰ 2) 24,25 ਦੁਆਰਾ ਸੰਸਾਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਟ੍ਰਿਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।MS/MS ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਮੇਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ MaxQuant26,27 ਨਾਲ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਸਪੈਕਟਰਾ ਤੋਂ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਨੂੰ xQuest28 ਅਤੇ SIM-XL29 ਓਪਨ ਸੋਰਸ ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪਾਈਪਲਾਈਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਨੈਟਵਰਕ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।SIM-XL ਸਧਾਰਨ ਜਾਂ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਚੇਨਾਂ ਅਤੇ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਚੇਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਣ ਲਈ ਸਕ੍ਰਿਪਟ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹ MS/MS29 ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਇੱਕ ਆਈਡੀ ਸਕੋਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਅੰਤਰ-ਸੰਦਰਭ ਨੂੰ ਦਰਜਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਕਈ ਉੱਚ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਅਤੇ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਣੂ ਡਾਇਨਾਮਿਕਸ (MD) ਮਾਡਲਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ 2) 30, 31 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਸੈੱਟ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
CLMS ਵਿਧੀ ਦੀ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਸੰਖੇਪ ਜਾਣਕਾਰੀ।ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 10 ng/ml IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਡੀਐਸਐਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੀਟੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅੱਗੇ LC-MS/MS ਦੌਰਾਨ ਪੇਪਟਾਇਡ ਪੂਰਵਜਾਂ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਲਈ ਨਮੂਨਾ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਰਾਸਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ) ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੀ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਪਛਾਣ ਮਸ਼ੀਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਸਪੈਕਟਰਾ ਤੋਂ ਦੋ ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਨੂੰ ਕੰਪਿਊਟੇਸ਼ਨਲ ਪਾਈਪਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਨੈਟਵਰਕ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਝੂਠੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਦਰ (FDR) ਸਕੋਰਾਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਭਰੋਸੇ ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ ਕਰੋ।ਕੋ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕਈ ਨਵੇਂ ਉੱਚ-ਪ੍ਰਤੀ-ਪ੍ਰਤੀ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਅਣੂ ਡਾਇਨਾਮਿਕਸ (MD) ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਕੁੱਲ ~ 30,500 ਅਤੇ ~ 28,500 ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਅਣਉਚਿਤ ਅਤੇ ਉਤੇਜਿਤ IFNα ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਮੈਕਸਕੁਐਂਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ S1, ਚਿੱਤਰ 3A)।ਦੋਵਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਵੰਡ ਨੇ ਵੱਡੇ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਉੱਚ ਅਨੁਪਾਤ ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਕਿ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਚਿੱਤਰ 3B,C) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ (ਚਿੱਤਰ 3C) ਵਿੱਚ 40-55 ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਅਨੁਪਾਤ ਮੌਜੂਦ ਸੀ।ਲੌਗ2 ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੈਪਿੰਗ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, ਅਤੇ HLA-F (ਚਿੱਤਰ 3D) ਸਮੇਤ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਕਲਾਸਿਕ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਸਨ।ਰੀਐਕਟੋਮ ਪਾਥਵੇਅ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ IFNα ਇਲਾਜ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਮਾਰਗਾਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ MHC-I-ਵਿਚੋਲੇ ਐਂਟੀਜੇਨ ਪ੍ਰਸਤੁਤੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਸਭ ਤੋਂ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਮਾਰਗ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3E)।ਪਿਛਲੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, OAS ਅਤੇ ISG15 ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਜਵਾਬਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ IFNα/β ਅਤੇ ਸਾਈਟੋਕਾਈਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਸਰਗਰਮ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਐਕੁਆਇਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਮਐਸ/ਐਮਐਸ ਸਪੈਕਟਰਾ ਤੋਂ ਲਾਇਸਿਨ- ਅਤੇ ਸੀਰੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ 5 ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ISG ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੇਸ਼ਨ ਅਧਿਐਨਾਂ ਦੇ ਮੈਟਾ-ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ 9 ਵਾਇਰਸ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ 20 ਵਾਇਰਸ ਫੈਲਣ ਵਾਲੇ 104 ISGs ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਵੱਡੇ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਦੀ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੀਆਂ ਕੰਪਿਊਟੇਸ਼ਨਲ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪਡਾਰੀਆ ਐਟ ਅਲ. ਦੁਆਰਾ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ IRDS ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਸੂਚੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਭਾਵੀ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਡੇਟਾਸੈਟ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਕੀਤੀ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ISGs ਹਨ।
IFNα (MaxQuant ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਡੇਟਾ) ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ।(A) IFNα14 ਦੇ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫਲੋ-1 ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਆਮ ਅਤੇ ਨਿਵੇਕਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਵੇਨ ਚਿੱਤਰ।ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ (B) ਅਤੇ IFNα ਟ੍ਰੀਟਿਡ (C) ਕਰਾਸਲਿੰਕ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਵੰਡ।(ਡੀ) ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ IFNα14 ਦੇ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਲੌਗ2 (LFQ ਤੀਬਰਤਾ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਗਰਮੀ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ।ਖੱਬਾ ਪੈਨਲ IFNα ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਰਗਰਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।(ਈ) ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ IFNα ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 20 ਮੁੱਖ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਮਾਰਗਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਰੀਐਕਟੋਮ ਪਾਥਵੇਅ ਡੇਟਾਬੇਸ ਨੇ ਅਪਰੇਗੁਲੇਟਿਡ IFNα-ਜਵਾਬਦੇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ।
ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਵਿਚੋਲੇ ਆਈਐਸਜੀ ਉਤੇਜਨਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦਸਤਾਵੇਜ਼ੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦਰਜ ਹੈ, ਪਰ ਅਣੂ ਦੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਇਹ ਮਾੜੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਮਝਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਕਾਰਜਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਕਿਵੇਂ ਖਤਮ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ISGs ਵਿਚਕਾਰ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਦੇ ਭਰੋਸੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਅਸੀਂ MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ਅਤੇ STAT1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੇਤ ਇੱਕ ਨੈਟਵਰਕ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ ਜੋ IFNα ਇਲਾਜ (ਚਿੱਤਰ 4, ਟੇਬਲ S2) 32,33,34 ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਣ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਇਹ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਟ੍ਰਿਪਲੀਕੇਟਸ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਉਹ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ IFNα ਇਲਾਜ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਇਹ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ STAT1 ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਹਨਾਂ ISGs ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ISGs ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।STAT1 ਦੀ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਇਸਦਾ ਹੈਲੀਕਲ ਡੋਮੇਨ (CCD) ਡਾਈਮਰਸ 35 ਦੇ ਗਠਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਡੀਐਨਏ ਜਾਂ ਪ੍ਰੋਟੋਮਰਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਇਹ α-ਹੇਲੀਸ ਇੱਕ ਹੈਲੀਕਲ ਹੈਲਿਕਸ ਬਣਤਰ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆਵਾਂ ਹੋਣ ਲਈ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫਿਲਿਕ ਸਤਹ ਖੇਤਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ 35।ਸਾਡੇ CLMS ਡੇਟਾ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ STAT1 ਨਾਲ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ SH2 ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ CCD, ਲਿੰਕਰ ਡੋਮੇਨ, ਜਾਂ C-ਟਰਮੀਨਲ ਟੇਲ (ਰਿਸ਼ੂ 700-708) (ਚਿੱਤਰ 4A) ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹੋਈਆਂ ਹਨ।ਇੱਕ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ USP18 STAT2 ਦੇ CCD ਅਤੇ DNA-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ (DBD) ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਟਾਈਪ I ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ 24 ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਲਈ ਟਾਈਪ I ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਰੀਸੈਪਟਰ IFNAR2 ਦੇ ਸਬਯੂਨਿਟ ਵਿੱਚ ਭਰਤੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਨੇ ਇਹ ਵੀ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ USP18 ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਡੋਮੇਨ STAT1 DBD (ਚਿੱਤਰ 4A,D) ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ STAT1 ਅਤੇ STAT2 ਦੋਵੇਂ USP18 ਨੂੰ IFNAR2 ਵੱਲ ਆਕਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ISG ਨੈੱਟਵਰਕ।(A) 2D ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਪਲਾਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ), ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਲਾਈਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ (ਕਰਾਸਲਿੰਕ ਕੱਟਆਫ 3.5 'ਤੇ ਸੈੱਟ)।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਛਾਣਾਂ ਦੇ ਡੋਮੇਨ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਰੰਗ 32 ਦੁਆਰਾ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ: MX1 ਡੋਮੇਨ, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), ਅਤੇ GED (569–660)।OAS3 ਡੋਮੇਨ: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ਅਤੇ OAS1_C (903-108)।ਡੋਮੇਨ ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ਅਤੇ fn3 (777–864)।STAT1 ਖੇਤਰ: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ਅਤੇ STAT1_TAZ2bind (715–739)।(ਬੀ) ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਨੀਲੇ ਅਤੇ ਲਾਲ ਵਿੱਚ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਅਤੇ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ਅਤੇ STAT1) ਦਾ ਸਰਕੂਲਰ ਦਰਸ਼ਕ।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.5 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡੌਟ ਪਲਾਟ MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ਅਤੇ OAS3 (F) ਦੇ ਨਾਲ STAT1 ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਦੋ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵਿਚਕਾਰ K ਜਾਂ S ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ, ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਸਕੋਰ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.0 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।(G) STAT1 ਅਤੇ OAS3 DI ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਪਾਈਮੋਲ (PyMOL ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਗ੍ਰਾਫਿਕਸ ਸਿਸਟਮ, ਸੰਸਕਰਣ 2.0 ਸ਼੍ਰੋਡਿੰਗਰ, ਐਲਐਲਸੀ) ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ;STAT1 (pdb id: 1bf533) ਅਤੇ OAS3 (pdb id: 4s3n34)।) ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ.
ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ USP18 ਦੇ ਦੋ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਇੱਕ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਬਿਨਾਂ N-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ, USP18-sf, ਜੋ ਕਿ cytoplasm ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ 36 ਵਿੱਚ ਬਰਾਬਰ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ ਨੂੰ ਅਸੰਤਰਿਤ ਹੋਣ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਆਈਸੋਪੇਪਟੀਡੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਜਾਂ ISG1537 ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਸਥਿਤ ਸਨ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ USP18 (ਚਿੱਤਰ 4A,D) ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਵਾਪਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਇਹ ਵੀ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਨ-ਟਰਮਿਨਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਤੋਂ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈ।IFNAR2 ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 312-368 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਅਤੇ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਵੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਸ ਖੇਤਰ (ਚਿੱਤਰ 4A) 37,38 ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਜੁੜਦਾ ਹੈ।ਇਕੱਠੇ ਲਏ ਗਏ ਇਹ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ IFNAR2 ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੀਸੈਪਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਿਰਫ਼ OAS3 ਅਤੇ ROBO1 ਹੀ N-ਟਰਮਿਨਸ ਅਤੇ IFNAR2 ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ (ਚਿੱਤਰ 4A) ਦੇ ਉੱਪਰਲੇ ਪਾਸੇ ਵਾਲੇ ਡੋਮੇਨਾਂ ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ।
ROBO1 ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ (Ig) ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਪੰਜ Ig ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਫਾਈਬਰੋਨੈਕਟਿਨ (Fn) ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਇੱਕ ਝਿੱਲੀ-ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ ਖੇਤਰ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਹੈਲਿਕਸ 39 ਦੇ ਬਾਅਦ ਆਉਂਦੇ ਹਨ। ਇੱਕ ਗੈਰ-ਸੰਗਠਿਤ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਖੇਤਰ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਸਥਿਤ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕ੍ਰਮ ਮੋਟਿਫ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਜੋ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਮੱਧਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ~ 1100 ਤੋਂ 1600 ਤੱਕ ਫੈਲਿਆ ਖੇਤਰ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਵਿਗਾੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ MX1 ROBO1 ਨਾਲ Ig, Fn, ਅਤੇ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨਾਂ ਰਾਹੀਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ STAT1 ਨਾਲ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਇਸਦੇ CCD, ਲਿੰਕਰ ਡੋਮੇਨ, ਅਤੇ ROBO1 (Fig. 4A,E) ਦੇ C-ਟਰਮਿਨਸ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਦੂਜੇ ਪਾਸੇ, DI, DIII, ਅਤੇ OAS3 ਲਿੰਕਰ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੂਰੇ ROBO1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਚਿੱਤਰ 4A) ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
oligoadenylate ਸਿੰਥੇਜ਼ (OAS) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਿਵਾਰ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ RNA (dsRNA) ਨੂੰ ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ, ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ 2′,5′-ਲਿੰਕਡ oligoadenylates (2-5 As) 40 ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਕਿ ਤਿੰਨ OASs ਵਿੱਚੋਂ, OAS3 dsRNA ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਬੰਧ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 2-5 As ਦੀ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ RNase L ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ 41 ਨੂੰ ਸੀਮਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।OAS ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਬੀਟਾ (pol-β) ਵਰਗੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਪਿਛਲੀ ਖੋਜ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ (ਡੀਆਈਆਈਆਈ) ਦੀ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਗਤੀਵਿਧੀ dsRNA-ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੋਮੇਨ (DI) 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜੋ OAS342 ਦੀ ਸਰਗਰਮੀ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ OAS3 ਦੇ DI ਅਤੇ DII ਡੋਮੇਨ CCD ਅਤੇ SH2 ਅਤੇ STAT1 TAD (ਚਿੱਤਰ 4A,F) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਜੰਕਸ਼ਨ ਖੇਤਰ ਨਾਲ ਅੰਤਰਕਿਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਓਵਰਲੇਅ ਕਰਨ ਨਾਲ β-ਸ਼ੀਟ ਅਤੇ DBD STAT1 ਲੂਪ ਅਤੇ OAS3 (Fig. 4G) ਦੇ DI ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 60-75 ਦੁਆਰਾ ਬਣੀ ਇੱਕ ਖੁੱਲੀ ਜੇਬ ਜਾਂ ਕੈਵਿਟੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਹੋਇਆ।ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਨੇ ਇਹ ਵੀ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ OAS3 ਨਾਲ ਕੋਈ ਵੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਇਸਦੇ DI ਡੋਮੇਨ (Fig. S1A) ਦੀ ਡੀਐਨਏ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਮਰੱਥਾ ਵਿੱਚ ਦਖ਼ਲ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, GTPase MX1 ਦਾ N-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ OAS3 (Fig. 4A) ਦੇ DI ਅਤੇ DIII ਡੋਮੇਨਾਂ ਨਾਲ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਤਿੰਨੋਂ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਦੁਹਰਾਓ ਵਿੱਚ OAS1 ਅਤੇ MX1 ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਵੀ ਦੇਖਿਆ, ਜਿੱਥੇ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ OAS1 ਡੋਮੇਨ (ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਵੀ) ਨੇ ਸਾਰੇ ਤਿੰਨ MX1 ਡੋਮੇਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ S2A,B) ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕੀਤੀ।
ਐਮਐਕਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਾਇਨਾਈਨ-ਵਰਗੇ GTPases ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪਰਿਵਾਰ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ N-ਟਰਮੀਨਲ GTPase ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ GTP ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟ ਡੋਮੇਨ ਜੋ ਸਵੈ-ਅਸੈਂਬਲੀ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ ਲਿਊਸੀਨ ਜ਼ਿੱਪਰ ਜੋ ਇੱਕ GTPase (LZ) ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। ).ਡੋਮੇਨ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਡੋਮੇਨ 25,43.MX1 ਵਾਇਰਲ ਜੀਨ 43 ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਵਾਇਰਲ ਪੌਲੀਮੇਰੇਸ ਦੇ ਉਪ-ਯੂਨਿਟਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਖਮੀਰ ਦੋ-ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਸਕ੍ਰੀਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PIAS1-ਸਬੰਧਤ MX1 ​​ਡੀਐਨਏ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ STAT1-ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ SUMO E344,45 ligase ਗਤੀਵਿਧੀ ਵੀ ਹੈ।ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ MX1 STAT1 (ਚਿੱਤਰ 4C,D) ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ IFNα ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ STAT1-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਵੀ ਪਾਇਆ ਕਿ MX1 ਨੇ IFIT3 ਅਤੇ DDX60 ਦੇ ਨਾਲ ਤਿੰਨੋਂ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਦੁਹਰਾਓ (Fig. S2C) ਵਿੱਚ ਗੱਲਬਾਤ ਕੀਤੀ।
DDX60 ਇੱਕ IFN-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਸਾਇਟੋਪਲਾਸਮਿਕ ਹੈਲੀਕੇਸ ਹੈ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ ਵਾਇਰਲ RNA46 ਦੇ RIG-I-ਸੁਤੰਤਰ ਪਤਨ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਣ ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਹ RIG-I ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਲਿਗੈਂਡ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਢੰਗ ਨਾਲ ਇਸਦੇ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ 46. DDX60 ਵਿੱਚ ਇੱਕ DEXD/H-Box ਹੈਲੀਕੇਸ ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ ਹੈਲੀਕੇਸ ਡੋਮੇਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਵਾਇਰਲ RNA ਅਤੇ DNA47 ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ।MX1 ਅਤੇ IFIT3 ਦੇ ਨਾਲ ਇਸ ਦੀਆਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲੰਬੇ N- ਅਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਡੋਮੇਨਾਂ ਜਾਂ ਰੂਪਾਂ (Fig. S2E,F) ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, MX1 DEXD/H-Box ਹੈਲੀਕੇਸ ਡੋਮੇਨ (Fig. S2E) ਨਾਲ ਵੀ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।IFIT ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਹੈਲਿਕਸ-ਟਰਨ-ਹੇਲਿਕਸ ਮੋਟਿਫ਼ ਦੀਆਂ ਟੈਂਡਮ ਕਾਪੀਆਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ ਜਿਸਨੂੰ ਟੈਟਰਾਪੇਪਟਾਇਡ ਰੀਪੀਟ (ਟੀਪੀਆਰ) ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।IFIT3 ਨੂੰ RIG-I ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਦਾ ਇੱਕ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਮੋਡਿਊਲੇਟਰ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇਸਲਈ MAVS ਕੰਪਲੈਕਸ ਦਾ ਇੱਕ ਹਿੱਸਾ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ IFIT3 ਅਤੇ DDX60 ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ IFIT3 ਦੇ TPR 3-6 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ RIG-I/MAVS ਸਿਗਨਲਿੰਗ (Fig. S2F) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਇਹ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਪੂਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦੀ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਗਣਨਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤੀਬਰ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਫਿਰ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਦੁਹਰਾਓ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਪੂਰੇ ਮਨੁੱਖੀ ਯੂਨੀਪ੍ਰੋਟ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਇਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਸਾਨੂੰ HLA-A ਲਈ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਨੈਟਵਰਕ ਮਿਲੇ ਹਨ।MS/MS ਸਪੈਕਟਰਾ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮਾਰਗਾਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ MHC-I- ਅਧਾਰਿਤ ਐਂਟੀਜੇਨ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਅਤੇ ਪ੍ਰਸਤੁਤੀ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ (ਚਿੱਤਰ 3D) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਮੁੱਖ ਮਾਰਗ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਰੇ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਦੇ ਭਰੋਸੇ ਨਾਲ MHC-I ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ।HLA ਵਿੱਚ α1, α2 ਅਤੇ α3 ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਲਾਈਟ ਚੇਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੋਬੂਲਿਨ β2 (β2m) ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਚੈਪਰੋਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ49।ਇੱਕ ਵਾਰ ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੇਟੀਕੁਲਮ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਹੋ ਜਾਣ ਤੇ, ਐਚਐਲਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲਿਗੈਂਡਸ50 ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਅਸਥਿਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਪੈਪਟਾਈਡ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਗਰੂਵ ਗੈਰ-ਪੇਪਟਾਇਡ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪੋਲੀਮੋਰਫਿਕ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਸੰਗਠਿਤ α1 ਅਤੇ α2 ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਅਤੇ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਪੋਲੀਮੋਰਫਿਕ α351 ਡੋਮੇਨ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।IFNα ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦੋ HLA-A ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ: ਇੱਕ HMGA1 ਅਤੇ H2B (ਚਿੱਤਰ 5, ਸਾਰਣੀ S3) ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਜਾ MDN1, LRCH4 ਅਤੇ H2B (ਚਿੱਤਰ 6) ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।
IFNα H2B (H2BFS) ਅਤੇ HMGA1 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ HLA-A ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਨੈੱਟਵਰਕ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।(ਏ) 2D ਪਲਾਟ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) H2B-HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀਆਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ: ਇੰਟਰਲਿੰਕ (ਨੀਲਾ), ਇੰਟਰਲਿੰਕ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਸਿੰਗਲ ਲਿੰਕ (ਕਾਲਾ)।.ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਛਾਣਾਂ ਦੇ ਡੋਮੇਨ ਰੰਗ ਕੋਡ 32 ਹਨ: H2B (ਹਿਸਟੋਨ; 2-102) ਅਤੇ MHC-I (MHC_1; 25-203, ਗਰੁੱਪ C1; 210-290 ਅਤੇ MHC_I_C; 337-364)।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.5 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਡੌਟ ਪਲਾਟ H2B (B) ਅਤੇ HMGA1 (C) ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਦੋ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵਿਚਕਾਰ K ਜਾਂ S ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ, ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਸਕੋਰ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.0 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।(ਡੀ) PyMOL ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ H2B, HLA-A, ਅਤੇ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ।ਇਹ ਢਾਂਚਿਆਂ ਨੂੰ Phyre2 ਸਰਵਰ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਡਲ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ H2B, HLA-A ਅਤੇ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਟੈਂਪਲੇਟ ਢਾਂਚੇ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1kx552, 1kj349 ਅਤੇ 2eze55 ਸਨ।
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 ਅਤੇ LRCH4 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ HLA-A ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਨੈੱਟਵਰਕ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।(A) ਇੱਕ 2D ਇੰਟਰਐਕਟਿਵ ਮੈਪ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ) 'ਤੇ MDN1 ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਚੱਕਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਤੁਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ (ਨੀਲਾ) ਕਰਾਸਲਿੰਕਸ।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.5 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਛਾਣਾਂ ਦੇ ਡੋਮੇਨ ਰੰਗ ਕੋਡ 32 ਹਨ: H2B (ਹਿਸਟੋਨ; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, ਗਰੁੱਪ C1; 210-290 ਅਤੇ MHC_I_C; 337-364) ਅਤੇ LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137–194) ਅਤੇ CH (535–641))।(ਬੀ) PyMOL ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ H2B, HLA-A, LRCH4, ਅਤੇ MDN1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀਆਂ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ।ਇਹਨਾਂ ਬਣਤਰਾਂ ਨੂੰ Phyre2 ਸਰਵਰ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ H2B, HLA-A, LRCH4 ਅਤੇ MDN1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਟੈਮਪਲੇਟ ਢਾਂਚੇ 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ਅਤੇ 6i2665 ਨਾਲ ਮਾਡਲ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ.H2B (C), LRCH4 (D), ਅਤੇ MDN1 (E) ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਲਈ K ਜਾਂ S ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਬਿੰਦੂ ਪਲਾਟ।ਪਲਾਟਾਂ ਲਈ, ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਸਕੋਰ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 3.0 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜੀਨੋਮ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖਣ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ, ਹਿਸਟੋਨ H2B ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਨਿਯਮ ਵਿੱਚ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।H2B ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕੇਂਦਰੀ ਹਿਸਟੋਨ ਡੋਮੇਨ (HFD) ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਲੂਪਸ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਤਿੰਨ α-helices ਅਤੇ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ ਟੇਲ 41,52 ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।H2B ਨਾਲ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ α1 ਹੈਲਿਕਸ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ HFD ਹੈਟਰੋਡਾਈਮਰ (ਚਿੱਤਰ 5A,B) ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਈਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਲਾਈਸਿਨ ਡੀਐਨਏ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਕੁਝ ਲਾਈਸਿਨ ਵਿਕਲਪਕ ਐਸੀਟਿਲੇਸ਼ਨ ਜਾਂ ਮੈਥਾਈਲੇਸ਼ਨ ਸਾਈਟਸ ਵੀ ਹਨ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, H2B ਤੋਂ K43, K46, ਅਤੇ K57 ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸਿੱਧੀ DNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਪਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੋਸਟ-ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਨਿਸ਼ਾਨੇ ਹਨ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, H2B ਵਿੱਚ K44, K47, ਅਤੇ K57 ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ IFNα ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਕ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਚਿੱਤਰ 5A, B) ਦੇ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਕਸਟਰਾਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮਲ ਹਿਸਟੋਨ H2B ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਛੂਤ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟਾਂ ਜਾਂ ਨੁਕਸਾਨੇ ਗਏ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਬਣੇ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ (dsDNA) ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਸਾਈਟੋਸੋਲਿਕ ਸੈਂਸਰ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, H2B ਦੀ ਕਮੀ IFN-β ਉਤਪਾਦਨ ਅਤੇ STAT154 ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ।H2B ਨੂੰ ਹੋਰ ਕੋਰ ਹਿਸਟੋਨਜ਼ ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਤੇ ਬਾਹਰ ਜਾਣ ਲਈ ਵੀ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ54।MDN1 ਅਤੇ LRCH4 ਦੇ ਨਾਲ H2B ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਚੁਣੇ ਗਏ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ HLA-A ਨੇ ਸਾਰੇ ਤਿੰਨ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਅਤੇ ਇੱਕ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਦੁਹਰਾਏ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ H2B ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕੀਤੀ।ਇਹ ਡੇਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਕ ਸਰੀਰਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਵਿੱਚ H2B ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
HMGA1 (ਉੱਚ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਸਮੂਹ AT-Hook 1), ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਿਹੀ ਨਿਊਕਲੀਓਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋ ਬਿਮਾਰੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਨਾਲ ਭਰਪੂਰ ਹੈ, ਨੂੰ HLA-A ਦੇ ਸਹਿਯੋਗ ਨਾਲ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ਾਬੀ C-ਟਰਮੀਨਲ ਪੂਛ ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ DBDs ਹਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ AT ਹੁੱਕ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ dsDNA55,56 ਵਿੱਚ AT-ਅਮੀਰ ਖੇਤਰ ਦੇ ਮਾਮੂਲੀ ਨਾਲੀ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਮੋੜਨ ਜਾਂ ਸਿੱਧਾ ਕਰਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਾਰਕਾਂ ਨੂੰ ਇਸਦੇ ਸਹਿਮਤੀ ਕ੍ਰਮ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਮਿਲਦੀ ਹੈ।ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਪੂਛ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਭਰਤੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਮਿਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮਿਊਟੈਂਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ 57 ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਸ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਕਈ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ ਹਨ ਜੋ ਕਿਨਾਸੇਜ਼ 58 ਲਈ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਜਾਣੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਬਾਹਰ HMGA1 ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਅਤੇ H2B ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੇਖਿਆ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ C-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਫੈਕਟਰ ਬਾਈਡਿੰਗ (Fig. 5A, C) ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਐਚਐਮਜੀਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਡਾਪਟਰ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਲਈ ਹਿਸਟੋਨ ਐਚ1 ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਪਹੁੰਚਯੋਗਤਾ ਵਧਦੀ ਹੈ57।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਹ ਸੰਭਾਵਨਾ ਜਾਪਦੀ ਹੈ ਕਿ HMGA ਹਿਸਟੋਨ H1 ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲੇ ਵਿੱਚ ਲਿੰਕਰ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਨਾਲ ਹਿਸਟੋਨ H2B ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਐਚਐਮਜੀਬੀ1 ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਐਚਐਲਏ-ਏ, -ਬੀ, ਅਤੇ -ਸੀ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ59, ਪਰ ਐਚਐਮਜੀ ਅਤੇ ਐਚਐਲਏ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ HMGA1 HLA-A ਦੇ α1 ਅਤੇ α3 ਡੋਮੇਨਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਸਦੇ 3 DBD (ਚਿੱਤਰ 5A,C) ਦੇ ਬਾਹਰ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।ਸਾਡੇ ਹੱਥਾਂ ਵਿੱਚ, HLA-A ਨੂੰ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਸਥਾਨਿਤ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ), ਅਤੇ ਇਹ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਕਿ H2B ਅਤੇ HMGA1 ਵੀ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹਨ, ਇਹ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਵਾਪਰਦਾ ਹੈ।H2B, HLA-A, ਅਤੇ HMGA1 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਖਾਸ ਐਡਕਟ ਚਿੱਤਰ 5D ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਦੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਇਸਦੇ α1 ਅਤੇ α2 ਡੋਮੇਨਾਂ ਅਤੇ ਵਿਗਾੜਿਤ C-ਟਰਮੀਨਲ ਡੋਮੇਨ (ਚਿੱਤਰ 6) ਦੇ ਅੰਦਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ HLA-A LRCH4 (ਚਿੱਤਰ 6A,D) ਦੀ ਵਿਗਾੜਿਤ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪੂਛ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ।LRCH4 TLR4 ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਅਤੇ LPS ਸਾਇਟੋਕਾਇਨ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਜਨਮਤ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ 60,61 ਨੂੰ ਮੋਡਿਊਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਇੱਕ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਨੌ ਲੀਯੂਸੀਨ-ਅਮੀਰ ਦੁਹਰਾਓ (LRRs) ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕੈਲਮੋਡਿਊਲਿਨ (CH) ਹੋਮੋਲੋਜੀ ਮੋਟਿਫ ਹੈ, ਇਸਦੇ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਡੋਮੇਨ (TMD) 60, 62 ਹੈ।CH ਡੋਮੇਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ 60 ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਨ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।LRR ਅਤੇ CH ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਲਗਭਗ 300 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦਾ ਇੱਕ ਫੈਲਾਅ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਪਹੁੰਚਯੋਗ ਹੈ ਪਰ ਵਿਗਾੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਅਤੇ ਵੇਸੀਕੂਲਰ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ 63 ਦੇ ਵਿਚੋਲੇ ਵਜੋਂ ਵਿਗਾੜ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਕੰਮ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿਗਾੜ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।MDN1 ਦੇ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ LRR1, LRR6, CH ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਬੇਤਰਤੀਬ ਖੇਤਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ H2B ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ CH ਡੋਮੇਨ (Fig. 6A, B) ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਿਸੇ ਵੀ ਗੱਲਬਾਤ ਵਿੱਚ TMJ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ CLMS ਪਹੁੰਚ (ਚਿੱਤਰ 6A, B) ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
MDN1 ਦੀ ਪਛਾਣ HLA-A ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈੱਟਵਰਕ (ਚਿੱਤਰ 6A) ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਏਏਏ ਪਰਿਵਾਰ (ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਏ.ਟੀ.ਪੀ.ਐਸ.) ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ।ਇਹ ਉਹੀ N-ਟਰਮੀਨਲ AAA ਡੋਮੇਨ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਹੈਕਸਾਮੈਰਿਕ ਰਿੰਗ ਵਿੱਚ ਸੰਗਠਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 60S 64 ਰਿਬੋਸੋਮਲ ਸਬਯੂਨਿਟ ਤੋਂ ਅਸੈਂਬਲੀ ਫੈਕਟਰ ਨੂੰ ਹਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।dynein64,65,66 ਦੇ ਸਮਾਨ ਜਾਪਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਏਐਸਪੀ/ਗਲੂ ਅਮੀਰ ਖੇਤਰ MIDAS ਡੋਮੇਨ (ਮੈਟਲ ਆਇਨ ਨਿਰਭਰ ਸਾਈਟ) ਦੇ ਬਾਅਦ ਆਉਂਦਾ ਹੈ।MDN1 (ਲਗਭਗ 5600 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ) ਦੇ ਵੱਡੇ ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਸੀਮਤ ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਬਣਤਰ ਅਤੇ ਕਾਰਜ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ HLA-A, H2B, ਅਤੇ LRCH4 ਨੂੰ MDN1 ਬਾਈਡਿੰਗ ਭਾਗੀਦਾਰਾਂ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਅਤੇ ਪਾਈਮੋਲ (ਚਿੱਤਰ 6A,B) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਜੋਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਇਹ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ AAA ਡੋਮੇਨ, ਡਾਇਨਾਈਨ-ਵਰਗੇ ਲਿੰਕਰ ਡੋਮੇਨ, ਅਤੇ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ MIDAS MDN1 ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਪਿਛਲੀ ਰਿਪੋਰਟ ਵਿੱਚ, ਦਾਣਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸਬੰਧ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੇ MDN1 ਨੂੰ ਹਿਸਟੋਨ H2B67 ਨਾਲ ਸਬੰਧਿਤ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਸਾਡੀ ਖੋਜਾਂ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਐਫੀਨਿਟੀ-ਪਿਊਰੀਫਾਈਡ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ HCT116 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MDN ਅਤੇ HLA-B ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਹੈ।IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਸ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਵਿੱਚ MDN1 ਲਈ ਇੱਕ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।
ਕਿਉਂਕਿ ਐਚਐਲਏ ਜੀਨ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪੌਲੀਮੋਰਫਿਕ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਆਰਐਨਏ ਸੀਕੁਏਂਸਿੰਗ ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਰੀਡ ਮੈਪਿੰਗ HLA-A, -B, ਅਤੇ -C ਨੂੰ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕੀਤਾ (ਡਾਟਾ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ)।ਕ੍ਰਮ ਰੀਡਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੇ ਉਹਨਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ HLA-A, -B, ਅਤੇ -C ਵਿਚਕਾਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਜਿੱਥੇ ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ HLA-A (ਚਿੱਤਰ S3) ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਸਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ HLA-B/C ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਤੋਂ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ।ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ HLA-A, MDN1, LRCH1 ਅਤੇ HMGA1 ਵਿਚਕਾਰ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ HLA-A ਖਾਸ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਗੈਰ-ਕਰਾਸਲਿੰਕਡ ਨਮੂਨਿਆਂ (ਟੇਬਲ S4) ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ HLA-A ਵਿੱਚ HLA-B ਜਾਂ HLA-C ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਉੱਚ ਕ੍ਰਮ ਕਵਰੇਜ ਹੈ।IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ HLA-A ਲਈ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ।
ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਇੱਥੇ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਸਥਾਨਿਕ ਨੇੜਤਾ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਕਾਰਨ ਨਹੀਂ ਸਨ, ਅਸੀਂ ਸਹਿ-ਇਮਿਊਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਅਸੇਸ ਦੁਆਰਾ ਦੋ ਨਵੇਂ HLA-A ਇੰਟਰੈਕਟਿੰਗ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ।IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 7, ਚਿੱਤਰ S4) ਦੋਵਾਂ ਵਿੱਚ ਐਂਡੋਜੇਨਸ MDN1 ਅਤੇ H2B ਨਾਲ HLA-A ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਸੀਂ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ HLA-A ਨੂੰ H2B ਦੁਆਰਾ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸਿਪੀਟੇਟਸ ਵਿੱਚ ਫੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਹ ਸਬੰਧ IFNα ਦੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਕਾਰਨ ਸੀ ਕਿਉਂਕਿ HLA-A ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ 7A) ਤੋਂ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰ ਸੀ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ IFNα H2B ਅਤੇ MDN1 ਲਈ HLA-A ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।IFNα H2B ਅਤੇ HLA-A ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਪਰ MDN1 ਨਾਲ ਇਸ ਦੇ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ MDN1 ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ HLA-A ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਅਤੇ IFNα ਦੇ ਜੋੜ ਨੇ IFNα (ਚਿੱਤਰ 7B,C) ਦੁਆਰਾ MDN1 ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਇਸ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, HLA-A ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਨੇ A549 ਸੈੱਲਾਂ (Fig. S4) ਵਿੱਚ H2B ਨੂੰ ਕੈਪਚਰ ਕੀਤਾ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮ ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਹੈ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ H2B ਅਤੇ MDN1 ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਦੇ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਵਿਚੋਲੇ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
HLA-A H2B ਅਤੇ MDN1 ਨੂੰ ਸਹਿ-ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਐਂਡੋਜੇਨਸ H2B (A) ਅਤੇ MDN1 (B) ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ ਨੂੰ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸਿਪੀਟਿਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੰਕੇਤ ਕੀਤੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਮਾਊਸ ਅਤੇ ਖਰਗੋਸ਼ IgG ਨੂੰ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।(ਸੀ) ਵੱਖ-ਵੱਖ ਐਂਟੀਜੇਨਾਂ ਦੀ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਮਾਤਰਾ (ਇਨਪੁਟ) ਸੰਕੇਤ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਜਾਂਚ ਕੀਤੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੌਟਸ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, β-ਐਕਟਿਨ ਨੂੰ ਲੋਡਿੰਗ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਬਹੁਤ ਹੀ ਭਰੋਸੇਮੰਦ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਨੈਟਵਰਕ, H2B-HLA-A-HMGA1 ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਦੀਆਂ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਅਸੀਂ ਇਸ ਕੰਪਲੈਕਸ (ਚਿੱਤਰ 8) ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਿਕ ਪਹੁੰਚ ਵਜੋਂ ਅਣੂ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।CLMS ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਅਨੁਮਾਨ H2B, HLA-A, ਅਤੇ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਰੂਪਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਲਈ, ਨਿਮਨਲਿਖਤ ਸੰਭਾਵੀ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਨੂੰ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਮਾਡਲ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ਅਤੇ H2B-HLA-A-HMGA1।MOE (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਓਪਰੇਟਿੰਗ ਐਨਵਾਇਰਮੈਂਟ; ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਗਰੁੱਪ ਇੰਕ., ਮਾਂਟਰੀਅਲ, ਕਿਊਬਿਕ, ਕੈਨੇਡਾ) ਪੈਕੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੌਕਿੰਗ ਸਕ੍ਰੀਨ ਨੇ ਸੰਭਾਵੀ ਰੂਪਾਂਤਰਾਂ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 8A) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖਰੇ ਹਨ।ਡੌਕਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਨੇ ਕਈ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ ਰੂਪਾਂਤਰਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 5A, 8).ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਚਿੱਤਰ 8A (ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਸ ਦੇ ਨਾਲ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵਿਤ ਰੂਪਾਂਤਰ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ MD ਮਾਡਲਿੰਗ ਪਾਈਪਲਾਈਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹੋਰ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, H2B ਜਾਂ HMGA1 ਨੂੰ HLA-A ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ HLA-A (Fig. 8A) ਲਈ H2B ਦੀ ਉੱਚੀ ਸਾਂਝ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ਅਤੇ H2B-HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਭਾਵਿਤ ਨੈੱਟਵਰਕਾਂ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ।(ਏ) ਖੱਬਾ ਪੈਨਲ ਇੱਕ 2D ਨਕਸ਼ਾ ਹੈ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ (ਨੀਲਾ) ਕਰਾਸਲਿੰਕਸ (ਕਰਾਸਲਿੰਕ ਕੱਟਆਫ 3.5 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ H2B, HLA-A, ਅਤੇ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਢਾਂਚੇ 'ਤੇ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।MOE ਪੈਕੇਜ ਵਿੱਚ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਡੌਕਿੰਗ ਪਾਈਪਲਾਈਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹੇਠਲਾ ਖੱਬਾ ਪੈਨਲ H2B-HLA-A ਅਤੇ HMGA1-HLA-A ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਐਫੀਨਿਟੀਜ਼ (GBVI/WSA dG; kcal/mol) ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੰਭਾਵਿਤ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।(ਬੀ) ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ ਲਈ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਸਥਿਤੀਆਂ (ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਪਰਮਾਣੂਆਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ) ਦਾ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ (RMSD)।(C) ਅੰਤਰਾਲ ≥ 10 ns ਦੇ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਿਮੂਲੇਟਡ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਤੋਂ ਅੰਤਰ-ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ।ਐਚ-ਬਾਂਡ ਦਾਨੀ-ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕੱਟਆਫ ਦੂਰੀ ਨੂੰ 3.5 Å ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਦਾਨੀ-H-ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਕੱਟਆਫ ਕੋਣ ≥ 160°–180° ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।(D) ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਜੋ HLA-A ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਆਪੋ-ਆਪਣੇ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ≥ 20 ns ਫੈਲਦੇ ਹਨ, ਡਮੀ HLA-A-H2B ਅਤੇ HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ 100 ns MDS ਦੀ ਔਸਤ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।(ਈ) ਦੋ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਵਿਚਕਾਰ K ਜਾਂ S ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ ਸਾਈਟ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ 100 ns ਤੋਂ ਵੱਧ H2B-HLA ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਟਰੈਕ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ HLA-A-H2B ਅਤੇ HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ।ਕੰਪਲੈਕਸ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਸ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਲਈ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਮੁੱਲ 3.0 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ≥ 10 ns ਲੈਣ ਵਾਲੇ MDS ਤੋਂ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।BIOVIA ਡਿਸਕਵਰੀ ਸਟੂਡੀਓ (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ਅਤੇ Molecular Operating Environment (MOE; ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਗਰੁੱਪ Inc., Montreal, Quebec, Canada) ਪੈਕੇਜਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ HLA-A ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ (ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ; RMSD ਜਾਂ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ; RMSF) ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ H2B ਜਾਂ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੇ HLA-A (ਚਿੱਤਰ 8B, ਚਿੱਤਰ S5) ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕੀਤਾ।HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ HLA-A ਦੀ B2M ਸਾਈਟ ਨਾਲ ਕੱਸ ਕੇ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ, HLA-A-HMGA1 ਜਾਂ H2B-HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸ (ਚਿੱਤਰ 8B, ਚਿੱਤਰ S5) ਵਿੱਚ HLA-A ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, HLA ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ~60-90 ਅਤੇ ~180-210 H2B (FIG. 8B) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਲਚਕਦਾਰ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ।H2B ਅਤੇ HMGA1 ਨੇ H2B-HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ H2B ਜਾਂ HMGA1 ਲਈ HLA-A ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ HLA-A ਨਾਲ ਬਿਹਤਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦਿਖਾਇਆ (ਚਿੱਤਰ 8C,D; ਟੇਬਲ S5)।ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬੰਧਨ (MD ਮਾਡਲਡ ਹਾਈ ਆਕੂਪੈਂਸੀ ≥ 10 ns) ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ CLMS ਇੰਟਰੈਕਸ਼ਨ ਸਾਈਟਾਂ (K ਜਾਂ S ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ) ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ CLMS ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਬਹੁਤ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਹਨ।ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ (ਚਿੱਤਰ 8E)।CLMS ਅਤੇ MD ਮਾਡਲਿੰਗ ਵਿੱਚ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ H2B ਅਤੇ HMGA1 ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਲਈ ਲਗਭਗ 190-210 ਅਤੇ ਲਗਭਗ 200-220 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ HLA-A ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ (FIG. 8E).
ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਢਾਂਚਾਗਤ ਨੈਟਵਰਕ ਬਣਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਕਿ ਕੁਝ ਉਤੇਜਨਾ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਸੰਚਾਰ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਕਿਉਂਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਪਹੁੰਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਮੁੱਚੀ ਸਥਿਰ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਇੰਟਰਫੇਸਾਂ ਨੂੰ ਹਾਸਲ ਕਰਨ ਲਈ ਵਾਧੂ ਸਾਧਨਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ CLMS ਇੱਕ ਅਜਿਹਾ ਸਾਧਨ ਹੈ।ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਸਿਸਟਮ ਇੱਕ ਸਾਇਟੋਕਾਇਨ ਨੈਟਵਰਕ ਹੈ ਜੋ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਵਾਤਾਵਰਣਕ ਜਰਾਸੀਮ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਰੋਗ ਸੰਬੰਧੀ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਸੀਮਾ ਦਾ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇਨਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਉਪ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ।ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ CLMS ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕੀ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ ਨਾਵਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਜਵਾਬਦੇਹ ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਗਲੋਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਨੂੰ ਹਾਸਲ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਗੈਰ-ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਅਤੇ ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਟ੍ਰਿਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਕੱਢਣਾ, ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ LFQ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਗਿਣਤੀ, ਪਾਥਵੇਅ ਸੰਸ਼ੋਧਨ, ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਵੰਡ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇਨਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਅੰਦਰੂਨੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਇੰਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ MX1, UP18, OAS3 ਅਤੇ STAT1 ਦੇ ਨਵੇਂ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਅਤੇ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਐਡਕਟਸ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਅਤੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
HLA-A, MDN1 ਅਤੇ H2B ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ Flo-1 ਅਤੇ A549 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ HLA-A IFNα-ਨਿਰਭਰ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ H2B ਦੇ ਨਾਲ ਕੰਪਲੈਕਸ ਹੈ।ਸਾਡਾ ਕੰਮ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਸਹਿ-ਸਥਾਨਕੀਕਰਨ ਦੀ ਹੋਰ ਖੋਜ ਲਈ ਇੱਕ ਦਿਲਚਸਪ ਮੌਕੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਸੈੱਲ-ਕਿਸਮ-ਸੁਤੰਤਰ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਵਿਚੋਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਪੈਨਲ ਵਿੱਚ CLMS ਪਹੁੰਚ ਦਾ ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਨਾ ਵੀ ਦਿਲਚਸਪ ਹੋਵੇਗਾ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ H2BFS-HLA-A-HMGA1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਿਕ ਪਹੁੰਚ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ MD ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਕਿ ਇੰਟਰਾਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਅਤੇ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਕਰਾਸ-ਟੌਕਸ ਨੂੰ ਟਰੈਕ ਕਰਦਾ ਹੈ।CLMS ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਅਨੁਮਾਨ H2BFS, HLA-A, ਅਤੇ HMGA1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਰੂਪਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਡੌਕਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਭਾਵਿਤ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੂਪਾਂਤਰਾਂ ਨੇ CLMS ਡੇਟਾਸੈਟ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਮਾਨ ਕਈ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ।ਸਾਡੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਖੂਬੀ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਹ HLA ਵਰਗੇ ਉੱਚ ਪੌਲੀਮੋਰਫਿਕ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਦੀ ਆਸਾਨ ਪਛਾਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਇਹ HLA ਹੈਪਲੋਟਾਈਪ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨਾ ਦਿਲਚਸਪ ਹੋਵੇਗਾ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ CLMS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਨੈਟਵਰਕਸ ਦੀ ਸਾਡੀ ਸਮਝ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਐਨਵਾਇਰਮੈਂਟ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਇੰਟਰਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਅਧਾਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ।
Flo-1 ਸੈੱਲ ATCC ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ DMEM (Gibco) ਵਿੱਚ 1% ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ/ਸਟਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ), 10% ਭਰੂਣ ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ (ਗਿਬਕੋ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਅਤੇ 37°C ਅਤੇ 5% CO2 ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ.IFNα14 (ਐਡਿਨਬਰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਉਤਪਾਦਨ ਸਹੂਲਤ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਮਿਤ) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 70-80% ਸੰਗਮ ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਹੋਰ ਸਾਰੇ ਰਸਾਇਣ ਅਤੇ ਰੀਐਜੈਂਟ ਸਿਗਮਾ ਐਲਡਰਿਕ ਤੋਂ ਖਰੀਦੇ ਗਏ ਸਨ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਹੋਰ ਨੋਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ।
ਫਲੋ-1 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 6-ਖੂਹ ਵਾਲੀਆਂ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਦਿਨ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 10 ng/ml IFNα14 ਨਾਲ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਲਗਭਗ 80% ਸੰਗਮ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 0.5 ਐਮਐਮ ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂਟੀਗਰੇਡ 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ ਤਾਜ਼ੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਡੀਐਸਐਸ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) (ਡੀਐਮਐਸਓ ਵਿੱਚ ਭੰਗ) ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਗਿਆ।DSS ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 37° C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ PBS ਵਿੱਚ 20 mM Tris (pH 8.0) ਜੋੜ ਕੇ ਬਾਕੀ DSS ਨੂੰ ਬੁਝਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਕ੍ਰੈਪਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਘੱਟ ਬਾਈਡਿੰਗ ਟਿਊਬਾਂ (ਐਕਸੀਜਨ) ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸੈੱਲ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ 300 μl ਯੂਰੀਆ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ (8 M ਯੂਰੀਆ, 0.1 M ਟ੍ਰਿਸ, pH 8.5) ਨਾਲ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ ਕਦੇ-ਕਦਾਈਂ ਹਿੱਲਣ ਦੇ ਨਾਲ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਾਰੇ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕਦਮ 14,000 xg 'ਤੇ 8°C 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਲਾਈਸੇਟ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰੋ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਨਵੀਂ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ।ਬਾਕੀ ਬਚੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਣਾਂ ਨੂੰ ਦੂਜੇ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ (2 ਐਮ ਯੂਰੀਆ, 2% (ਡਬਲਯੂ/ਵੀ) ਐਸਡੀਐਸ (ਸੋਡੀਅਮ ਡੋਡੇਸਾਈਲ ਸਲਫੇਟ)) ਦੇ 150 μl ਵਿੱਚ 30 ਮਿੰਟ ਜਾਂ ਇਸ ਤੋਂ ਵੱਧ ਲਈ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਇੱਕ ਸਮਰੂਪ ਜਲਮਈ ਘੋਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਹੀਂ ਹੋ ਜਾਂਦਾ।ਲਾਈਸੇਟ ਨੂੰ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਪਿਛਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਲਾਈਸੇਟ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਾਈਕ੍ਰੋਪਲੇਟ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਿਦਾਇਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਬੀਸੀਏ ਪਰਖ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨੇ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ -80 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਲਗਭਗ 100 μg ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਫਿਲਟਰੇਸ਼ਨ ਨਮੂਨਾ ਤਿਆਰੀ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ (FASP) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੰਸਾਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਵਿਸਨੀਵਸਕੀ ਐਟ ਅਲ ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।69 ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 200 µl ਯੂਰੀਆ ਬਫਰ (0.1 M ਟ੍ਰਿਸ ਵਿੱਚ 8 M ਯੂਰੀਆ, pH 8.5) ਦੇ ਨਾਲ ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਵੋਰਟੈਕਸਡ ਅਤੇ ਅੱਧਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਸਾਰੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕਦਮ 25°C 'ਤੇ 14,000 xg 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਾਈਸੇਟ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਅੱਧ ਨੂੰ ਇੱਕ ਅਲਟਰਾਸੈਲ-10 ਝਿੱਲੀ (ਮਰਕ) ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ 10 kDa ਮਾਈਕ੍ਰੋਕਨ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗਲ ਫਿਲਟਰ ਯੰਤਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 25 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਫਿਲਟਰ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਅੱਧ ਨੂੰ ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਅਤੇ ਉਹੀ ਕਦਮ ਦੁਹਰਾਓ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰਿਕਵਰੀ ਯੂਰੀਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 100 μl 17 mM ਟ੍ਰਿਸ (2-ਕਾਰਬਾਕਸਾਇਥਾਈਲ) ਫਾਸਫਾਈਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਲੋਰਾਈਡ (TCEP) ਜੋੜ ਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਰਿਕਵਰੀ ਨੂੰ ਥਰਮੋਮਿਕਸਰ 'ਤੇ 600 rpm 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟ ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਹਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਯੂਰੀਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 100 μl 50 mM iodoacetamide ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਘਟਾਏ ਗਏ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਅਲਕਾਈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਅਲਕੀਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਘੁੰਮਾਓ, ਕਾਲਮ ਦੀਆਂ ਕੰਧਾਂ ਨੂੰ 100 μl ਯੂਰੀਆ ਬਫਰ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਵੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰੋ।100 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ ਦੇ 100 μl ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਹੀ ਓਪਰੇਸ਼ਨ 3 ਵਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਕਲੈਕਸ਼ਨ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਨਵੀਂ ਨਾਲ ਬਦਲੋ।ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਬਫਰ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ) ਵਿੱਚ 50 ਐਮਐਮ ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ ਅਤੇ 1 µl ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਪਤਲਾ ਪਾਚਨ ਬਫਰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ।ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਲਗਭਗ 1:33 'ਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪਾਚਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਨਮੀ ਵਾਲੇ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ 37° C. 'ਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਰਾਸਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ 25 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਫਿਲਟਰ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚ 0.5 M NaCl ਦਾ 50 μl ਜੋੜ ਕੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਰਿਕਵਰੀ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 25 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
C18 ਮਾਈਕ੍ਰੋ ਸਪਿਨ ਕਾਲਮ (ਹਾਰਵਰਡ ਉਪਕਰਣ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਮਾਮੂਲੀ ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਬੌਚਲ ਐਟ ਅਲ.70 ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਿਤ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਬਾਅਦ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਟ੍ਰਾਈਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਡੀਸਾਲਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, C18 ਸਪਿਨ ਕਾਲਮ ਐਸੀਟੋਨਿਟ੍ਰਾਇਲ (AcN) (Merck) ਵਿੱਚ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (FA) ਦੇ ਤਿੰਨ ਵਾਸ਼ ਅਤੇ 0.1% FA ਦੇ ਦੋ ਵਾਸ਼ਾਂ ਨਾਲ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਕਾਲਮ ਨੂੰ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 0.1% FA ਨਾਲ ਹਾਈਡਰੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਸਪਿਨ ਕਾਲਮਾਂ ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕਰੋ ਅਤੇ 0.1% FA ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਧੋਵੋ।0.1% FA ਵਿੱਚ 50%, 80% ਅਤੇ 100% AcN ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡੀਸਾਲਟਡ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਇੱਕ ਪੜਾਅਵਾਰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਅਲੋਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਪੀਡਵੈਕ ਪਲੱਸ ਕੰਨਸੈਂਟਰੇਟਰ (ਐਪੇਨਡੋਰਫ) ਵਿੱਚ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਸੁੱਕਿਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਬਾਕੀ ਬਚਿਆ ਤਰਲ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਗਾਇਬ ਨਹੀਂ ਹੋ ਜਾਂਦਾ।2.5% AcN ਵਿੱਚ 100 μl 0.08% ਟ੍ਰਾਈਫਲੂਓਰੋਸੈਟਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਅਲਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਇੱਕ NanoDrop 2000 (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰਤੀ ਨਮੂਨਾ ਲਗਭਗ 1 μg ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡ LC-MS/MS ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਅਲਟੀਮੇਟ 3000 RSLCnano LC ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਉੱਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਇੱਕ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਐਕਸਪਲੋਰਿਸ 480 ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਇੱਕ 300 µm ID 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 5 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਲੰਬੇ µ-ਪ੍ਰੀ-ਕਾਲਮ C18 ਕੈਪਚਰ ਕਾਲਮ C18 PepMap100 sorbent ਅਤੇ 5 µm PepMap ਸੋਰਬੈਂਟ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।2.5% AcN ਵਿੱਚ ਘੁਲਿਆ ਹੋਇਆ ਪੰਪ ਫਲੋਅ ਸੈੱਟ 5 μl/min 0.08% ਟ੍ਰਾਈਫਲੂਓਰੋਸੈਟਿਕ ਐਸਿਡ ਲੋਡ ਕਰੋ।ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ 75 μm ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ ਅਤੇ 150 mm ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਫਿਊਜ਼ਡ ਸਿਲਿਕਾ ਕਾਲਮ 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇੱਕ 2 μm PepMap ਸੋਰਬੈਂਟ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਮੋਬਾਈਲ ਪੜਾਅ A ਅਤੇ B ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ 0.1% FA ਅਤੇ ਐਸੀਟੋਨਾਈਟਰਾਇਲ ਵਿੱਚ 0.1% FA ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਗਰੇਡੀਐਂਟ 2.5% B ਤੋਂ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 90 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਰੇਖਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ 40% B ਤੱਕ ਵਧਦਾ ਹੈ, ਫਿਰ ਅਗਲੇ 2 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 90% B ਤੱਕ।ਮੋਬਾਈਲ ਪੜਾਅ ਦੀ ਰਚਨਾ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 90% B 'ਤੇ ਬਣਾਈ ਰੱਖੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 2 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 2.5% B ਤੱਕ ਲੀਨੀਅਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟ ਗਈ ਸੀ।ਅਗਲੇ ਚੱਕਰ ਤੋਂ 8 ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ ਕਾਲਮ ਨੂੰ 2.5% B 'ਤੇ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕ ਕਾਲਮ ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਕ੍ਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਨੈਨੋਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (NSI) ਸਰੋਤ ਵਿੱਚ ਆਇਨਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਐਕਸਪਲੋਰਿਸ 480 ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਐਕਸਪਲੋਰਿਸ 480 ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਕੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਚਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਪੂਰਾ ਸਕੈਨ ਸੈਕਸ਼ਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ 120,000 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਵਿੱਚ m/z 350 ਤੋਂ m/z 2000 ਤੱਕ ਸੀਮਾ ਸੈਟਿੰਗਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਧਾਰਣ AGC ਟੀਚਾ 50ms ਦੇ ਅਧਿਕਤਮ ਇਨਪੁਟ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ 300% 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮੋਨੋਇਸੋਟੋਪਿਕ ਪੀਕ ਖੋਜ ਨੂੰ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਲਈ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਜੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਪੂਰਵ-ਸੂਚਕ ਮਿਲੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਸੀਮਾ ਛੋਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਸਹੀ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਪ੍ਰੀਕਰਸਰ ਦੀ ਨਿਊਨਤਮ ਆਇਓਨਿਕ ਤਾਕਤ ਨੂੰ 5.0e3 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ +8 ਤੱਕ ਪੂਰਵ-ਸੂਚਕ ਚਾਰਜ ਅਵਸਥਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਡੇਟਾ ਕੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਸਕੈਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਚੱਕਰ ਦਾ ਸਮਾਂ 2.5 ਸਕਿੰਟ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਪੁੰਜ ਬੇਦਖਲੀ ਨੂੰ ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਆਇਨ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਵਿਖੰਡਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 20 ਸਕਿੰਟ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਵਿੰਡੋ ਨੂੰ 2ਵੇਂ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ ਮੋਡ ਦੇ ਨਾਲ ਸਧਾਰਣ ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ ਦੀ ਕਿਸਮ ਇੱਕ ਡਾਟਾ ਨਿਰਭਰ MS/MS ਸਕੈਨ ਵਿੱਚ ਚੁਣੀ ਗਈ ਸੀ।ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ 30% 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਹੈ।ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 15,000 ਅਤੇ AGC ਦਾ ਟੀਚਾ 100% 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਕਸਟਮ ਅਧਿਕਤਮ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ 60 ਮਿਲੀਸਕਿੰਟ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੈਟਵਰਕ ਨੂੰ ਟਰੈਕ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਖੋਜਣ ਯੋਗ ਪੇਪਟਾਇਡਸ/ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਮੈਕਸਕੁਐਂਟ ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 1.6.12.0)26,27 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੱਚੀਆਂ ਫਾਈਲਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, IFNα ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਣਕਰੌਸਲਿੰਕ ਫਲੋ-1 ਨਮੂਨਿਆਂ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।MS/MS ਡੇਟਾ ਨੂੰ UniProt ਮਨੁੱਖੀ ਡੇਟਾਬੇਸ (www.uniprot.org) ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (12 ਅਗਸਤ, 2020 ਨੂੰ ਅੱਪਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 75,093 ਐਂਟਰੀਆਂ ਹਨ) ਬਿਲਟ-ਇਨ ਖੋਜ ਇੰਜਣ ਐਂਡਰੋਮੇਡਾ27 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ।ਖੋਜ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਡੈਮੀਡੇਸ਼ਨ (ਐਨ, ਕਿਊ) ਅਤੇ ਆਕਸੀਕਰਨ (ਐਮ) ਦੀਆਂ ਵੱਖ ਵੱਖ ਸੋਧਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਏ ਬਿਨਾਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪੂਰਵ ਮਾਸ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ 20 ppm ਅਤੇ ਉਤਪਾਦ ਆਇਨ 0.02 Da 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਅਤੇ ਅਧਿਕਤਮ ਪੁੰਜ ਵਿਵਹਾਰ 10 ppm 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪੇਪਟਾਇਡ ਦਾ ਅਧਿਕਤਮ ਪੁੰਜ 4600 Da 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕ੍ਰਮ ਸਮਾਨਤਾ 7 ਅਤੇ 25 ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ (aa) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪਰਸੀਅਸ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ (ਵਰਜਨ 1.6.10.45) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹੋਰ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਮਗਰੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਤੀਬਰਤਾ (LFQ ਤੀਬਰਤਾ; ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲੀ ਮਾਤਰਾ) 27 ਨੂੰ ਸਧਾਰਣ ਕਰਕੇ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ Log2 ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਇੱਕ ਲੜੀਵਾਰ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਪੇਪਟਾਇਡ ਤੀਬਰਤਾ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ R (v 4.1.2) ਵਿੱਚ ਫੀਟਮੈਪ (v1.0.12) ਪੈਕੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਲਈ ਰੀਐਕਟੋਮ ਪਾਥਵੇਅ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਾਥਵੇਅ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਸਨ।
ਐਲਸੀ-ਐਮਐਸ/ਐਮਐਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਲਾਈਸਿਨ (ਕੇ) ਜਾਂ ਸੀਰੀਨ (ਐਸ) ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰਸਾਇਣਕ ਕਰਾਸਲਿੰਕਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ) 29 ਲਈ ਸਪੈਕਟਰੋਸਕੋਪਿਕ ਪਛਾਣ ਮਸ਼ੀਨ (ਸਿਮ-ਐਕਸਐਲ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪਹਿਲਾਂ, ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-ਸਬੰਧਤ (IFN) ਡੀਐਨਏ ਨੁਕਸਾਨ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਦਸਤਖਤ (IRDS) ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਭਾਵੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਡਾਰੀਆ ਐਟ ਅਲ.28 ਵਿੱਚ ਵਰਣਿਤ IRDS ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾਸੈਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜਾਂਚਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਸਮੁੱਚੀ ਮਨੁੱਖੀ ਯੂਨੀਪ੍ਰੋਟ ਦੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਅਤੇ ਦੁਹਰਾਓ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨਾ ਗਣਨਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤੀਬਰ ਹੈ, ਇਸਲਈ IFNα-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਦੁਹਰਾਓ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਪੂਰਾ ਮਨੁੱਖੀ UniProt ਡੇਟਾਬੇਸ (www.uniprot.org) (12 ਅਗਸਤ 2020 ਨੂੰ ਡਾਊਨਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, 75,093 ਐਂਟਰੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ)।ਉੱਚ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਲਈ ਫਿਲਟਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ।ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇਹ ਉੱਚ-ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਸਾਰੇ ਦੁਹਰਾਓ ਅਤੇ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਫੈਲਾਇਆ ਅਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
SIM-XL ਵਿੱਚ, DSS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਾਸਲਿੰਕਰ (XL) ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ XL ਵੇਟ ਸ਼ਿਫਟ ਅਤੇ ਸੋਧ ਵੇਟ ਸ਼ਿਫਟ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 138.06 ਅਤੇ 156.07 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਹੇਠ ਲਿਖੀਆਂ ਕਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ: KK, KS ਅਤੇ KN-TERM, ਰਿਪੋਰਟਰ ਆਇਨਾਂ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ।ਦੋਨੋ ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਅਤੇ ਟੁਕੜਾ ppm 20 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ Xrea ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ 0.15 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਖਾਸ ਮੰਨਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਉੱਚ-ਊਰਜਾ ਸੀ-ਟਰੈਪ (HCD) ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਵਿਧੀ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।XCorr ਗਤੀਸ਼ੀਲ DB ਕਟੌਤੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਅਤੇ ਡਾਇਨਾਮਿਕ DB ਕਟੌਤੀ ਲਈ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਸੰਖਿਆ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 2.5 ਅਤੇ 2 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਹੋਰ ਮਾਪਦੰਡ ਹਨ: ਮੋਨੋਇਸੋਟੋਪ ਸੰਭਾਵਨਾ ਅਤੇ ਸਿਖਰ ਸੰਜੋਗ ਕੱਟਆਫ, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 4 AA ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਪ੍ਰਤੀ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਚਾਰਜ, ਅਤੇ ਖੁੰਝੇ ਹੋਏ ਸਪਲਿਟਸ ਦੇ 3 ਅਧਿਕਤਮ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸਿਲੇ ਕੀਤੇ 2D ਨਕਸ਼ਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (SIM-XL) ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ xQuest28 ਗ੍ਰਾਫਿਕਲ ਨੁਮਾਇੰਦਗੀ 2D ਨਕਸ਼ੇ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਾਸਲਿੰਕਸ ਪਾਈਮੋਲ (ਪਾਈਮੋਲ ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਗ੍ਰਾਫਿਕਸ ਸਿਸਟਮ, ਸੰਸਕਰਣ 2.0 ਸ਼੍ਰੋਡਿੰਗਰ, ਐਲਐਲਸੀ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮਾਡਲ ਬਣਤਰਾਂ ਨੂੰ Phyre2 ਸਰਵਰ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 11 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਮਰੂਪਤਾ ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਅਤੇ "ਲੁਕਵੇਂ ਮਾਰਕੋਵ ਵਿਧੀ" ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।Phyre2 ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਮਾਡਲ ਬਣਤਰ ਤਿਆਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ਅਤੇ MDN1 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਢਾਂਚੇ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ਅਤੇ 6i2665 ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, AlphaFold71 MX1, UBP18 ਅਤੇ ROBO1 ਦੀ ਬਣਤਰ 'ਤੇ ਵੀ ਵਿਚਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ ਨੂੰ BIOVIA ਡਿਸਕਵਰੀ ਸਟੂਡੀਓ ਵਿਜ਼ੁਅਲਾਈਜ਼ਰ ਪੈਕੇਜ (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ਅਤੇ ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਓਪਰੇਟਿੰਗ ਇਨਵਾਇਰਮੈਂਟ ਪੈਕੇਜ (MOE; ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਗਰੁੱਪ ਇੰਕ., ਮਾਂਟਰੀਅਲ, ਕਿਊਬਿਕ, ਕੈਨੇਡਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।